紅米米糠非淀粉多糖的提取純化與結構表征

李雪超,趙建偉,周星,金征宇

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

紅米是我國產量最大的有色米[1]。紅米中維生素和黃酮的含量分別是普通糙米的14.23倍和5.58倍[2],且含有普通糙米中缺乏的維生素C與硒元素[3-4]?！侗静菥V目》中記載紅米可以健脾利胃、活血祛瘀[5],現代科學也對紅米的抗氧化[6-7]、抗癌[8]、降血糖[9]、預防肥胖[10]等生理活性進行報道。目前對于紅米生理活性物質的報道集中在多酚上,多糖也是一類重要的生理活性物質,具有抗氧化[11]、抗菌[12]、降血脂[13]和抗癌[14]等生理活性。紅米中富含纖維素、淀粉、半纖維素等多糖資源,纖維素和半纖維素集中分布于米糠中,淀粉集中分布于胚乳中。半纖維素等多糖存在可以溶于水的部分,但目前并未將水溶性多糖劃分到具體的多糖分類中。目前以水為介質發揮多種生理功能的水溶性多糖被廣泛研究,但是對于水溶性的紅米米糠非淀粉多糖的提取純化及結構分析缺乏相關研究。紅米米糠非淀粉多糖的提取純化與結構分析有利于充分利用紅米的營養價值,促進紅米高附加值產品的開發,為其在食品、化妝品和生物醫藥等領域的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料:井岡山紅糙米(2022年新稻),井岡山市新城紅米米業加工廠。

實驗試劑:無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、NaOH、三氟乙酸、鹽酸、碘、KI、KBr、果糖、間苯二酚、乙腈、甲醇,國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、甘露糖,北京百靈威科技有限公司;剛果紅試劑,北京伊諾凱科技有限公司;DEAE-52 Cellulose、Sephadex G-200,上海源葉生物科技有限公司;鼠李糖、巖藻糖、核糖、木糖、半乳糖醛酸,上海麥克林生化科技股份有限公司;大孔吸附樹脂AB-8,東鴻化工有限公司;葡聚糖標品,Sigma-Aldrich公司;其中乙腈、甲醇為HPLC級,其余為分析純。

1.2 儀器與設備

JGMJ8098精米研磨機,上海嘉定糧油儀器有限公司;AX244ZH/E電子天平,奧豪斯儀器(常州)有限公司;HHS-21-6水浴鍋、GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱,上海博迅實業有限公司醫療設備廠;RW20 digital數顯頂置式攪拌器,德國IKA集團;SHZ-95B型循環水式多用真空泵,予華儀器有限責任公司;L4-5KR臺式低速冷凍離心機,湖南可成儀器設備有限公司;SCIENTZ-18N冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司;Waters e2695型高效液相色譜儀,美國Waters公司;RE-52AA旋轉蒸發器,上海亞榮生化儀器廠;UV-1800紫外光譜儀,日本島津公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鄭州科泰實驗設備有限公司;XD-DCY-24SL氮吹儀,上海析譜儀器有限公司;IS10傅里葉紅外光譜,美國Nicolet公司;M5酶標儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅米米糠非淀粉多糖的提取與除雜

將紅米米糠∶乙醇以1∶30的料液比混合,乙醇浸提2次后烘干并粉碎。將紅米米糠與60 ℃的熱水以1∶50的料液比混合,60 ℃下以150 r/min轉速提取5 h。提取結束后3 220×g離心24 min后留存上清液。將500 g活化后的大孔吸附樹脂AB-8投入紅米米糠多糖提取液中,利用頂置式攪拌器以245 r/min轉速攪拌脫色2 h。再生大孔吸附樹脂AB-8后,重復上述步驟直至將多糖溶液由醬紅色脫色至無色。將V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1的比例配制Sevag試劑,將紅米米糠多糖溶液旋蒸濃縮后,加入體積為紅米米糠多糖水溶液1/5的Sevag試劑,利用頂置式攪拌器在600 r/min下攪拌除蛋白30 min,將混合液轉入分液漏斗中靜置10 min分層,放出下層混有蛋白沉淀的有機相溶液,上清液重復除蛋白直至無蛋白質沉淀產生。將上清液旋蒸濃縮后,加入4倍體積乙醇在4 ℃下沉淀24 h,3 220×g離心24 min后將沉淀復溶,在3 500 Da透析袋中透析72 h,得到除雜后的紅米米糠非淀粉多糖(non-starch polysaccharides from red rice bran, RRBP)。

1.3.2 紅米米糠非淀粉多糖分離純化

將透析液旋蒸濃縮后,過0.8 μm水系膜,上樣后分別用超純水、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mol/L的NaCl溶液各200 mL洗脫DEAE-52 Cellulose層析柱,用10 mL離心管以9 mL/管盛接上樣液和洗脫液,根據苯酚硫酸法測定各管中性糖含量,即200 μL洗脫液與100 μL 5%苯酚溶液混合,加入700 μL硫酸后,在40 ℃下水浴30 min,在490 nm下測定吸光值,以洗脫管數為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制洗脫曲線。將相同洗脫峰的洗脫液進行合并、旋蒸濃縮,1 000 Da透析各組分濃縮液。利用超純水洗脫Sephadex G-200分離RRBP4組分,根據苯酚硫酸法測定各管中性糖含量并收集單一組分,旋蒸濃縮后凍干。

1.3.3 分子質量分布

將RRBP4溶于超純水中配成10 g/L的溶液,過0.22 μm水系膜后測定多糖的分子質量分布。通過Waters高效液相系統搭配示差檢測器進行測定,具體條件為色譜柱:UltrahydrogeTMLiniear(6 μm,7.8 mm×300 mm);流動相:0.1 mol/L NaNO3;流速:0.5 mL/min;柱溫:40 ℃;檢測器:RI;將葡萄糖、Dextran T-5、Dextran T-10、Dextran T-150、Dextran T-300、Dextran T-2000配制成10 g/L的水溶液,按照上述條件制作分子質量標準曲線。

1.3.4 單糖組成

取20 mg多糖組分于水解管中,加入8 mL 2 mol/L三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)溶液,充分搖勻后氮吹封管,置于110 ℃油浴鍋中水解6 h。70 ℃下氮吹至干,加入甲醇反復氮吹至pH為中性,用500 μL超純水溶解水解產物。在500 μL標準品或樣品中加入300 μL 0.3 mol/L NaOH溶液,1 250 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)甲醇溶液,置于70 ℃水浴鍋中反應1 h。加入2.5 mL氯仿渦旋混合后吸棄下層有機相,重復3次。過0.22 μm水系膜后用高效液相色譜測定單糖組成。并以0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL單糖標品溶液進行PMP衍生化后根據下列條件測定,以單糖濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

高效液相色譜條件:色譜柱XBridgeTMC18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相為乙腈∶0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)=18∶82;紫外檢測器波長245 nm;柱溫30 ℃;流速1 mL/min;樣品洗脫時間45 min;進樣量20 μL。

1.3.5 部分酸水解

根據MENG等[15]的方法并進行修改,取50 mg RRBP4于水解管中,加入8 mL 0.1 mol/L TFA溶液,氮吹封管,置于100 ℃油浴鍋中水解1 h。利用3 500 Da透析袋在蒸餾水中透析48 h。將外部的透析液55 ℃旋蒸濃縮至5 mL后,70 ℃水浴氮吹至干,記為R4-0.1-3.5kDa-out。將透析袋內部的多糖溶液旋蒸濃縮至5 mL后水浴氮吹至干,加入8 mL 0.5 mol/L TFA,混勻后氮吹封管,在100 ℃下水解1 h。將水解液置于3 500 Da透析袋中透析48 h,透析外液是蒸餾水。透析袋外的部分是多糖的側鏈,記為R4-0.5-3.5kDa-out,透析袋內的部分是多糖的主鏈,記為R4-0.5-3.5kDa-in。按照1.3.4節將各部分完全酸水解并測定單糖組成。

1.3.6 紅外光譜

將干燥的KBr粉末與干燥的RRBP4以100∶1的質量比混合研磨,壓片后利用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1下進行掃描。

1.3.7 β-消除反應

在8 mg的RRBP4中加入4 mL超純水和4 mL 0.2 mol/L NaOH溶液,混合均勻,置于45 ℃水浴環境下中反應30 min,在190～400 nm下測定紫外光譜掃描。

1.3.8 I2-KI實驗

根據WU等[16]的方法,取5 mg的RRBP4多糖樣品,配制成1 mg/mL的溶液,加入800 μL I2-KI試劑(0.2 g/L碘+2 g/L KI),渦旋混合均勻后,靜置10 min,在300～700 nm下進行紫外光譜掃描。

1.3.9 剛果紅實驗

通過剛果紅實驗對多糖三螺旋結構進行測定,將5 mg RRBP4在2.0 mL超純水中溶解,加入2.0 mL 80 μmol/L的剛果紅試劑,逐滴加入4 mol/L NaOH溶液,使體系中NaOH濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L,混合均勻后分別在400～600 nm下進行紫外光譜掃描。

1.3.10 數據分析

每組實驗至少做3次平行,使用SPSS 26.0對數據進行統計分析,實驗數據以平均值±標準差表示。通過方差分析(ANOVA)和Tukey檢驗在95%顯著性水平上評估結果的統計顯著性。

2 結果與分析

2.1 紅米米糠非淀粉多糖分離純化

由圖1和表1可知,RRBP經DEAE-52 Cellulose分離后得到5個峰,分別命名為RRBP1、RRBP2、RRBP3、RRBP4和RRBP5,各組分分別由超純水、0.1、0.2、0.4、0.8 mol/L NaCl溶液洗脫制得,而在利用1.0 mol/L和1.2 mol/L的NaCl溶液洗脫時無新的峰出現。RRBP1為中性多糖,分布在水洗脫液中[17],占RRBP的7.39%,RRBP2、RRBP3、RRBP4和RRBP5為酸性多糖,可由NaCl溶液洗脫下來,RRBP中酸性多糖占比為92.61%。其中RRBP4占比最大,為46.07%,故選擇此組分為后續實驗的實驗對象。

表1 DEAE-52 Cellulose分離RRBP后各組分占比Table 1 The proportion of each component after the isolation of RRBP by DEAE-52 Cellulose

圖1 DEAE-52 Cellulose分離RRBP的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of DEAE-52 Cellulose separating RRBP

用Sephadex G-200分離RRBP4組分(圖2),得到單一且具有一定對稱性的峰。

圖2 Sephadex G-200分離RRBP4的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of Sephadex G-200 separating RRBP4

2.2 分子質量分布

由圖3可知,RRBP4的洗脫峰均為單峰且峰型較窄,說明分子質量比較集中,與Sephadex G-200的單個洗脫峰結論相同。

圖3 RRBP4的分子質量分布Fig.3 Molecular weight distribution of RRBP4

RRBP4的重均分子質量為1.65×105Da,在Sephadex G-200的分離范圍內,也說明葡聚糖凝膠的型號選擇正確。張瀟艷[18]利用微波輔助提取法制得的米糠多糖重均分子質量為1.21×105Da。ZHA等[19]利用熱水提取米糠多糖并用乙醇分級沉淀,得到分子質量為1.2×105～6.3×105Da、3.4×104～7.4×104Da、5.3×103～2.3×104Da的3個組分。米糠多糖的分子質量集中在104～105Da,相比于細菌的胞外多糖等超大分子多糖,具有更小的分子質量,在一定范圍內分子質量低的多糖組分在治療中可以更好的跨過生物屏障,促進多糖發揮其生理功能。

2.3 單糖組成

表2為各單糖標品的標準方程,各單糖的“濃度-峰面積”標準曲線的線性關系較好。根據圖4可知,RRBP4由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成,其摩爾比例為0.29∶1.93∶0.35∶1.41∶0.50∶1.00∶5.58∶1.67∶2.56。RRBP4中糖醛酸摩爾分數為12.48%,所以RRBP4是由9種單糖組成的以半乳糖為主的酸性雜聚糖。ZHA等[19]利用熱水提取的米糠多糖中含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖,是以葡萄糖為主的中性雜多糖。相比之下,RRBP4具有更多的單糖組成,并富含糖醛酸。

表2 各單糖標品的出峰時間及“濃度-峰面積”標準方程Table 2 Peak time and “concentration-peak area” standard equation of each monosaccharide

圖4 RRBP4單糖的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC pattern of RRBP4 monosaccharides

2.4 部分酸水解

經過0.1 mol/L TFA水解后,多糖中的末端部分被水解下來,主鏈和側鏈部分存在于透析袋中,第一次水解的透析外液,即R4-0.1-3.5kDa-out的單糖組成及比例為多糖末端的單糖組成[20]。經過0.5 mol/L TFA水解后,側鏈部分被水解下來,留存于透析袋內部的是多糖主鏈的部分[15]。

表3為RRBP4部分酸水解后各部分單糖組成及比例,RRBP4中末端單糖組成種類較少,是以木糖為主并含有少量半乳糖醛酸和阿拉伯糖的多糖末端。在側鏈中以半乳糖為主,說明RRBP4側鏈主要由半乳糖構成,相比多糖末端和主鏈,側鏈中單糖種類最豐富,含有RRBP4的全部單糖組成。主鏈以阿拉伯糖為骨架,但是不含有半乳糖醛酸。在所有單糖組成中,只有甘露糖和阿拉伯糖在主鏈中的含量高于側鏈,其余的單糖更多的分布在側鏈,多糖側鏈含有62.40%的單糖,而主鏈含有28.36%的單糖,表明RRBP4是一種高度支化的多糖。

表3 部分酸水解后各部分單糖組成及比例Table 3 Composition and proportion of monosaccharides in each part after partial acid hydrolysis

2.5 紅外光譜

由圖5可知,RRBP4在3 600～3 200 cm-1的吸收峰強且寬,此峰為—OH特征吸收峰,說明RRBP4是含有分子內氫鍵和分子間氫鍵的多聚物。在2 950～2 850 cm-1為C—H伸縮振動,—OH和C—H的吸收峰也是多糖的特征吸收峰?！狢OO—反對稱拉伸產生的峰在1 630～1 600 cm-1,對稱拉伸產生的峰在1 400 cm-1[21],并且1 630～1 600 cm-1、1 400 cm-1和1 100 cm-1均為羧基的特征峰,表明組分中含有糖醛酸[22],與單糖組成結果相符。RRBP4中α-糖苷鍵吸收峰在792 cm-1,與葉振泉[23]研究結果相似,可能是由于多糖中富含氫鍵,使分子中電子云密度平均化,伸縮振動頻率降低,吸收波長向低波數移動。

圖5 RRBP4的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrogram of RRBP4

2.6 β-消除反應

圖6是RRBP4經NaOH處理前后紫外掃描光譜,RRBP4利用堿溶液孵育后,會導致最大吸收波長(λmax)變大,說明RRBP4中存在O-糖肽鍵,是一種含有氨基酸的多糖,這與YAMAGISHI等[24]闡述米糠多糖是蛋白聚糖的結論一致。多糖可以與蛋白質的絲氨酸和蘇氨酸β-位羥基之間形成O-糖肽鍵,在堿性條件下可以發生β-消去反應,而N-糖肽鍵在堿性條件下依舊可以保持穩定。RRBP4的紫外光譜圖在260、276和280 nm處無峰,說明不含核酸、紅米色素和蛋白質,即蛋白質、色素等雜質脫除效果較好。

圖6 RRBP4經NaOH處理前后紫外掃描光譜圖Fig.6 UV scanning spectrogram of RRBP4 before and after NaOH treatment

2.7 I2-KI實驗

由圖7可知,RRBP4與KI試劑混合反應后,在300～700 nm范圍內最大吸收峰位于343 nm,在565 nm沒有吸收峰,說明多糖樣品中存在長側鏈或者高度支化[25-26],這也與單糖部分酸水解的結果相符,進一步佐證RRBP4的分支化程度較高。反應后的溶液依舊是I2-KI的顏色,不具有淀粉的特征顯色反應,在紫外光譜中也并未檢測出其他峰,說明多糖樣品中不含淀粉[27]。

圖7 RRBP4與I2-KI溶液反應后的紫外掃描光譜圖Fig.7 UV-scanned spectrogram of RRBP4 after reaction with I2-KI solution

2.8 剛果紅實驗

根據圖8可知,隨著NaOH溶液濃度增加,多糖-剛果紅溶液持續發生紅移,最大吸收波長(λmax)逐漸變大,溶液也變成藍紫色。在各NaOH溶液濃度下,多糖-剛果紅溶液最大吸收波長相比于剛果紅溶液相差20 nm以上[28],說明RRBP4具有三螺旋結構。紫薯多糖在0.1 mol/L NaOH溶液中λmax達到最大[29],在0.1～0.4 mol/L NaOH溶液濃度范圍內λmax逐漸減小,多糖的三螺旋構象逐漸解構。RRBP4和溶劑的分子間氫鍵和分子相互作用使得多糖的3條鏈結合在一起,多糖側鏈的存在可以使多糖的三螺旋結構更加穩定,所以在0.5 mol/L的NaOH溶液濃度下,RRBP4多糖組分依舊可以保持三螺旋構象。

圖8 RRBP4的剛果紅溶液在不同NaOH濃度下的最大吸收波長(λmax)Fig.8 Maximum absorption wavelength (λmax) of RRBP4 Congo red solutions at different NaOH concentrations

3 結論

采用60 ℃熱水提取5 h得到的RRBP,經過DEAE-52 Cellulose和Sephadex G-200分離純化后得到RRBP4組分。結構分析結果表明,RRBP4的重均分子質量為1.65×105Da。RRBP4由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成,其摩爾比例為0.29∶1.93∶0.35∶1.41∶0.50∶1.00∶5.58∶1.67∶2.56,是一種含有氨基酸的酸性雜聚糖。RRBP4多糖鏈末端以木糖為主;側鏈以半乳糖為主,并含有62.40%的單糖,是一種高度分支的多糖;主鏈以阿拉伯糖為基本骨架。RRBP4含有α-糖苷鍵,富含分子內及分子間氫鍵,且具有三螺旋構象。對紅米米糠非淀粉多糖的提取純化及其中組分RRBP4的結構進行分析,為進一步開發紅米米糠水溶性多糖的功能奠定基礎。