膜分離法提高麥芽四糖糖漿純度的研究

李佳明,張宏建,王靚,陳旭升,張建華*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

麥芽四糖(maltotetraose, G4)是一種由4個α-D-吡喃葡萄糖單元以α-1,4-糖苷鍵連接而成的典型的直鏈麥芽低聚糖[1]。由于其黏度高[2]、熱量低、保濕性能好、增稠作用強、能延緩淀粉老化[3]以及成膜能力好等特性,在食品和化妝品領域有著廣泛的應用;此外由于其易于消化吸收,能促進人體對鈣離子的吸收,改善腸道環境,并且不易被酵母利用等特點,也常應用于醫藥行業。因此,對于麥芽四糖的研究也受到了廣泛的關注。

目前麥芽四糖主要通過酶法制備,其中包括淀粉液化、糖化、分離等步驟。KIMURA等[4]將麥芽四糖生成酶(EC 3.2.1.60)固定在大孔疏水樹脂上實現了麥芽四糖的連續生產,并在1990年采用固定床型生物反應器完成了麥芽四糖的生產[5]。錢瑩等[6]通過對糖化pH、溫度等條件進行了優化,得到了純度為52%的麥芽四糖,但并未給出優化后的具體操作條件。信成夫等[7]對糖化pH、溫度、糖化程度進行了正交優化,得到了純度為57%的麥芽四糖。事實上,純度高于95%的麥芽四糖常用于標準品的定量分析,而純度高于80%的麥芽四糖則在食品以及化妝品行業有著廣泛的應用。目前市售的高純度麥芽四糖一般用于定量分析的標準,通常是采用色譜法制得,但是該方法是間歇性的,并且效率很低,不適用于大規模生產。LI等[8]采用模擬移動床將麥芽四糖純度提高至81%,但麥芽四糖的收率只有69%,此外該方法具有耗水量大等弊端。在純化的策略中,膜分離法由于其節能、高效、環保、過程簡單、無相變等優點[9-10],而被大家所看好。DE OLIVEIRA等[11]采用納濾法從甘蔗水解液中回收低聚木糖;SCHMIDT等[12]以果糖、乳糖混合溶液為研究對象,探究了溫度、壓力和濃度對納濾分離單糖與二糖的影響;BANDINI等[13]對采用納濾法結晶母液中回收葡萄糖的可能性進行了研究。但目前采用膜分離法來提高麥芽四糖含量尚未見到報道。

本文旨在完成麥芽四糖的純化,得到高純度的產品,應用于科研等各個行業中。為此,本研究采用“超濾+納濾“組合的膜分離法,嘗試去除糖化副產物,將產品中麥芽四糖的純度提升至80%以上。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

麥芽四糖糖漿,實驗室自制;葡萄糖(glucose,G1)、麥芽糖(maltose,G2)、麥芽三糖(maltoriose,G3)、麥芽四糖(G4)標準品,上?；菡\生物科技有限公司;醋酸鈉、無水乙醇、HCl、NaOH等常規試劑,分析純,國藥集團化學試劑有限公司。實驗所用膜均為1812型卷式膜,泰州星達膜科技有限公司,基本參數見表1。

表1 膜性質Table 1 Membrane properties

1.2 實驗設備

XK-1812膜分離設備,南京軒科環?？萍加邢薰?HH-602型水浴鍋,常州金壇良友儀器有限公司;HPAEC-PAD配有脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜,美國Thermo Scientific有限公司。

圖1 膜分離系統示意圖Fig.1 Schematic diagram of membrane system

1.3 膜分離過程

在進料質量濃度10 g/L,跨膜壓差1.0 MPa,操作溫度25 ℃的條件下,根據分離系數、滲透通量、各糖截留率等指標進行膜的篩選。在此基礎上,對跨膜壓差、溫度、進料濃度等操作件進行優化,每次實驗進料體積4 L。為確保系統穩定,每改變操作條件時,循環30 min系統穩定后測定滲透通量并取樣分析。

間歇滲濾的進料體積為4 L,在進料質量濃度15 g/L,跨膜壓差1.0 MPa,操作溫度35 ℃的條件下,當截留液體積降到原始體積一半時,向截留液中加入去離子水恢復至原始體積,重復此過程5次。

1.4 玉米淀粉酶解產物組成的分析

取一定質量的麥芽四糖糖漿,稀釋后取上清液并過0.22 μm水系膜,用HPAEC-PAD分析酶解產物中低聚糖組成[14-15]。

1.5 糊精分子質量的分析

參照王寶石[16]的方法測定糊精分子質量分布特征。

1.6 膜通量

膜分離操作過程中,料液循環30 min,待系統穩定后收集并計量1 min內的滲透液體積,按公式(1)計算膜通量(Jp):

(1)

式中:Jp,膜通量,L/(h·m2);Vp,滲透液體積,L;Am,有效過濾面積,0.2 m2;t,過濾時間,h。

1.7 溶質截留率的計算

按1.4節的方法檢測料液與滲透液中G1、G2、G3、G4的質量濃度,按公式(2)計算截留率(R):

(2)

式中:ρf,進料液溶質濃度,g/L;ρp,滲透液溶質濃度,g/L。

1.8 分離系數

分離系數在本實驗中用于評估G4、G3兩種物質的分離效率(α),其計算公式(3)為:

(3)

式中:p,滲透液,f,料液;ρG4、ρG3分別為G4、G3的質量濃度,g/L;RG3、RG4分別為G3、G4的截留率。

1.9 濃縮因子

濃縮過程中的濃縮因子定義如公式(4)所示:

(4)

式中:V0,初始時進料體積,L;VR,濃縮結束時的進料體積,L。

1.10 純度

純度的計算如公式(5)所示:

(5)

式中:Pn,某一小分子糖的純度,%;ρn,某一小分子糖的質量濃度,g/L;ρ,樣品中G1-G4的總質量濃度,g/L。

1.11 數據處理

實驗結果均為3次實驗的平均值,用平均值±標準偏差表示;采用Origin 2021、Excel軟件處理數據和作圖;用SPSS 20的單因素方差分析(ANOVA)和Student-Newman-Keuls 程序進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 超濾預處理糖化產物

因麥芽四糖糖漿中除小分子糖外,仍然有大分子質量糊精的存在,這會給后續的納濾操作帶來很大影響。因此采用截留分子質量為1 000 Da的超濾膜(XT),在進料質量濃度10 g/L,跨膜壓差0.6 MPa,操作溫度25 ℃下對麥芽四糖糖漿進行預處理。表2所示為超濾前后各糖的純度、小分子糖總濃度以及糊精分子質量分布的變化,可以看出超濾前后各糖純度及小分子糖總濃度差異較小,說明此超濾膜做到了對小分子糖的回收,避免了操作過程中目標產物的損失,同時超濾后高分子質量聚集區的所占面積減少了72%,且重均分子質量從37.90 kDa下降到了10.08 kDa,表明超濾除去了大量的大分子質量糊精,為后續納濾純化麥芽四糖打下了基礎。

表2 超濾前后的糊精分子質量分布、各糖純度及小分子糖總濃度Table 2 The molecular weight distribution of dextrin, the purity of each sugar and the total concentration of small molecular sugar before and after ultrafiltration were analyzed

2.2 納濾膜的篩選

以小分子糖總質量濃度為10 g/L的麥芽四糖超濾滲透液為原料,在跨膜壓差1.0 MPa,操作溫度25 ℃下進行了各納濾膜的篩選,結果如表3所示。隨著納濾膜截留分子質量的提高,其滲透通量也在不斷上升。除膜NFG外,其他納濾膜的G4截留率均保持在97%以上,有利于G4的回收,其中膜NFX較膜NFW、NDF,有最低的G2、G1截留率,最高的分離系數(G4/G3),更有利于完成G4與其他小分子糖的分離,達到提高麥芽四糖純度的目標。因此在后續的研究中,選擇膜NFX進行研究。

表3 各納濾膜的分離性能Table 3 Separation performance of each membrane

2.3 跨膜壓差對膜NFX分離性能的影響

在以壓力為驅動力的納濾過程中,跨膜壓差是主要的傳質驅動力,也是影響截留率、滲透通量、膜污染的重要因素。以小分子糖總質量濃度為10 g/L超濾滲透液為原料,在操作溫度為25 ℃下,探究跨膜壓差對膜NFX分離性能的影響。隨著跨膜壓差的增加,納濾膜滲透通量的變化呈現先升高、在1.0 MPa后增長趨勢變緩慢(圖2-a)。這可以通過Darcy定律與串聯阻力模型來解釋,當跨膜壓差較低時,傳質阻力的變化較小,滲透通量隨著傳質推動力(跨膜壓差)的增加而增加,當跨膜壓差繼續增加時,膜表面的污染以及濃差極化的加劇,傳質阻力的變化程度強于跨膜壓差的變化,導致滲透通量不再增加。

a-跨膜壓差對滲透通量以及分離系數的影響;b-跨膜壓差對各物質截留率的影響

圖2-b顯示了在其他條件都相同時,跨膜壓差對各小分子糖截留率的影響。膜NFX對G4、G3的截留率維持在較高水平,且隨著跨膜壓差的增加而緩慢增長,但G2、G1的截留率有較為明顯的上升趨勢。通常情況下,跨膜壓差對納濾過程的影響有2種競爭現象。一方面,壓力的增加導致溶劑通量的增加,但溶質的傳輸受到空間效應和電效應的阻礙。因此,較高的溶劑滲透通量導致較低的滲透物濃度,從而造成截留率的增加;另一方面,跨膜壓差的增加會將更多的溶質輸送到膜表面,并導致更高的濃差極化效應,并且溶質在高濃度梯度下有通過膜輸送的趨勢。濃差極化甚至可通過降低電荷效應導致溶質截留率降低[17]。這兩個過程將決定納濾膜在不同跨膜壓差下的最終截留率[18]。

在1.0 MPa下膜NFX的G4平均截留率為99.29%。繼續增加跨膜壓差,雖然能得到更高的滲透通量,分離系數(G4/G3)也會增加,但滲透通量的提升十分有限,而更高的跨膜壓差會增加分離G2、G1的難度,也會增加運行成本。因此,在后續的實驗中選擇跨膜壓差為1.0 MPa進行其他條件的探究。

2.4 操作溫度對納濾膜NFX分離性能的影響

以小分子糖總質量濃度為10 g/L超濾滲透液為原料,在1.0 MPa下,探究操作溫度對膜NFX分離性能的影響。隨著操作溫度的不斷升高,滲透通量也隨之升高(圖3-a)。TSURU等[19]對這種現象給出了3種解釋:1)溶劑分子在較高溫度下增加的熱能,使得它們能夠克服由于孔壁摩擦力在微孔中產生的能量勢壘;2)由于親水性空隙表面上的吸附水層變薄,導致有效孔徑隨著溫度增加而增加;3)高溫降低了料液黏度,從而導致滲透通量升高。

a-操作溫度對各物質滲透通量和分離系數的影響;b-操作溫度對各物質截留率的影響

如圖3-b所示,隨著操作溫度的增加,G4截留率并沒有明顯變化,G3的截留率從97.67%下降到91.49%,G2 的截留率從80.53%下降到63.71%,G1的截留率從26.17%下降到14.91%。操作溫度的增加,提高了G4與G3的分離系數(圖3-b),進一步增強了膜NFX的分離性能。這是由于溫度的升高加強了水與溶質的傳質[20],同時也增強了溶質的擴散作用[21],并使得膜孔徑熱膨脹,加強了溶質通過膜的運輸,最終導致G3、G2、G1,截留率下降,滲透通量增加。

由于當溫度高于35 ℃時,G4與G3分離系數(圖3-b)不再發生變化,且滲透通量的增加也較為緩慢,更高的操作溫度也會導致納濾膜使用壽命的衰減,因此選擇35 ℃作為后續實驗的操作溫度。

2.5 進料濃度對納濾膜NFX分離性能的影響

在操作壓力為1.0 MPa,操作溫度為35 ℃下,探究進料濃度對納濾膜NFX分離性能的影響。隨著進料濃度的升高,滲透通量不斷下降(圖4-a)。這是由于進料濃度越大,在操作過程中越容易出現濃差極化現象[12],進而導致滲透通量的降低;此外,進料濃度的增加,也會增加溶液黏度并增厚動態膜[22],使得糖類物質附著在膜表面,進一步加劇膜污染,使得傳質阻力升高。另外更高的進料濃度也會增加滲透壓,降低膜分離的有效推動力最終導致滲透通量降低。因此,選擇合適的進料濃度對麥芽四糖的分離純化具有重要指導作用。

a-進料濃度對滲透通量以及分離系數的影響;b-進料濃度對各物質截留率的影響

不同進料濃度下,各糖截留率的變化如圖4-b所示。隨著進料濃度的升高,G4、G3的截留率變化較小,其中G4的截留率逐漸接近99%,而G2、G1的截留率則呈現先增加后趨于平緩的趨勢。同時隨著進料濃度的增加,分離系數也不斷增加。這是由于進料濃度增加,會增強濃差極化并導致動態膜加厚[23],最終導致各小分子糖的截留率都有不同程度的上升。在一些研究中,因為濃差極化作用占主導,出現了隨著進料濃度的增加,溶質截留率降低的現象[12]。

在進料質量濃度低于15 g/L時,G1、G2的截留率增長較為緩慢,而當進料質量濃度高于15 g/L時,G1、G2截留率則出現了明顯的上升趨勢,分離難度上升,雖然分離系數一直處于增加的狀態,但這主要是G4截留率高造成的。而當進料質量濃度高于15 g/L時,滲透通量的下降較為迅速,也將延長分離操作時間,增加了染菌的風險。因此在綜合考慮下,選擇進料質量濃度為15 g/L作為后續研究的初始進料濃度。

按照上述優化后的操作條件,納濾至不產水時G4純度由73.40%提高至78.20%,未能達到G4純度80%的分離目標。因此后續采用間歇滲濾進一步提高G4的純度。

2.6 間歇滲濾

在間歇滲濾過程中,每階段濃縮后,加入純水的進料溶液成為下一階段的濃縮進料液。濃縮步驟采用膜NFX在錯流下進行,其中進料質量濃度15 g/L,操作溫度35 ℃,跨膜壓差1.0 MPa,各階段的濃縮因子為2。間歇滲濾過程中通量的變化如圖5-a所示,整個過程分為5個階段,總操作時間約1.72 h。在各濃縮階段中,溶質濃度隨著濃縮時間的延長而增加,造成濃差極化以及膜污染加劇[24],導致滲透通量隨著操作時間的延長而減少?？梢灶A見的是,在間歇滲濾期間對進料溶液的再稀釋會對滲透通量有積極的影響。一旦進料溶液被再稀釋,滲透通量就能增加到初始值甚至更高。在第一個濃縮階段中,滲透通量由初始的32.54 L/(m2·h),在20 min后下降到26.22 L/(m2·h)。但在經過對第一階段截留液加水稀釋后,滲透通量恢復至35.29 L/(m2·h),說明滲濾過程中濃差極化的影響有限[25]。溶質濃度在間歇滲濾過程中的變化如圖5-b所示,由于間歇滲率過程中除去了一些小分子低聚糖,溶質濃度隨著每個階段的間歇滲濾而降低。由于各物質的截留率不同,如圖5-c所示,當進行到第四階段時,葡萄糖已被基本去除,在第五階段時G4回收率為92.15%。由圖5-d可以看出,在第二階段時G4純度已經從最開始的73.54%提升至80.71%,達到了分離目標,在第五階段時,G4純度達到87.14%。

a-滲透通量;b-總糖濃度的變化;c-各低聚糖濃度占比的變化;d-G4純度的變化

3 結論

本文采用“超濾+納濾“組合膜分離的方法來提高G4的純度。截留分子質量1 000 Da的超濾膜可以去除大分子質量糊精,同時回收小分子糖,適用于納濾前的糖漿預處理;截留分子質量為150～300 Da的納濾膜(NFX),對G4的截留率高,對其他小分子糖截留率較低,適用于提高G4純度;在最優操作條件下納濾后G4純度由73.40%提升至78.20%;進一步經過濃縮因子為2的5個階段的間歇滲濾,在第二階段完成了將G4純度從73.54%提升至80%的目標,并在第五階段將G4純度提升至87.14%,G4回收率達92.15%。由于G4與G3相對分子質量相近,膜分離雖然不能完成兩者的絕對分離,但可以提高產品中麥芽四糖的比例,對進一步研究麥芽四糖的應用價值就有重要意義。