壬醛與香芹酚復合抑菌微膠囊的制備及其對藍莓的保鮮作用

戴瑤,陳玥琰,張翔,王莉,李梅青,高學玲,張海偉

(安徽農業大學 茶與食品科技學院,農業農村部江淮農產品精深加工與資源利用重點實驗室,安徽省農產品加工工程實驗室,安徽 合肥,230036)

藍莓果實富含花青素、維生素、葉酸、膳食纖維、礦物質等營養物質與功能成分[1],具有提高人體免疫力、改善視力、抗衰老等功效,被聯合國糧農組織列為人類五大健康食品之一[2],且藍莓果肉口感細膩多汁,滋味酸甜適宜,深受消費者地喜愛。截至2020年底,我國藍莓栽培面積約6.64萬公頃,年產量約34.72萬t,發展速度較快[3]。但是藍莓的成熟期在5～8月,此時正值高溫多雨季節,加上藍莓果實皮薄汁多,極易受到機械損傷而被微生物侵染,并且病原菌對藍莓植株的侵染具有普遍性、長久性[4-5]。在藍莓采后致病菌的相關研究中,發現經分離、純化后的主要病害病原菌為灰霉菌,其帶菌率可達81.85%[6],被侵染后的藍莓果實極易腐爛變質,造成極大的經濟損失。因此研究抑制藍莓采后灰霉病生長的保鮮技術,對延長藍莓貨架期具有重要意義。

植物精油是從植物的不同部位(如根、莖、葉、花、果實)提取出的具有特定香氣的一類次生產物,一般采用有機溶劑萃取、水蒸氣蒸餾、機械擠壓、超臨界萃取、吸附等方法[7]。大量研究表明植物精油具有抑制微生物、抗氧化、增香調味等作用,應用范圍極廣,并且與化學試劑相比具有低毒、無殘留、副作用小、環保等優點[8]。將不同精油或精油活性成分組合使用可達到協同增效的作用[9],例如將丁香酚與檸檬醛聯合使用對腐敗菌青霉菌和曲霉菌均具有協同抑制作用,聯合應用于面包保鮮可比使用單個檸檬醛精油延長5 d保質期[10]。武延利[11]研究發現將丁香精油、肉桂精油與山蒼子精油的主要成分丁香酚、肉桂醛與檸檬醛三者復配使用,對草莓致病菌灰霉菌的生長具有協同抑制作用,聯用時的最小抑菌濃度比單用丁香酚時最小抑菌濃度降低75%。

精油雖然具有良好的抑菌性能,但由于氣味刺激、穩定性差、易揮發等缺點限制了其在實際生產生活中的應用,而利用微膠囊技術可將液體狀態的精油包埋入環糊精、明膠、殼聚糖等壁材中,形成固體狀態,從而改善精油缺點,達到持續緩慢釋放的目的[12-14]。王冰玉等[15]采用羧甲基殼聚糖包埋檸檬醛精油制備成微膠囊應用于刺嫩芽保鮮,結果表明檸檬醛微膠囊減緩了刺嫩芽營養成分的流失。另有研究報道,將肉桂醛、檸檬香茅、薰衣草精油分別用β-環糊精、蜂蠟、明膠與阿拉伯膠包埋制備成精油微膠囊,通過研究其結構性能及應用,發現這些精油被包埋后穩定性增強、氣味減弱并且具有良好緩釋性能,可延長西瓜、芒果等水果的貯藏時間[16-18]。

本文采用棋盤法聯合抑菌實驗篩選出具有協同抑制灰霉菌作用的復合精油,并以此為芯材,β-環糊精為壁材,采用飽和水溶液法制備微膠囊,通過響應面優化法確定復合精油微膠囊的最佳制備條件,對微膠囊的形貌、粒徑、抑菌性能、緩釋性能等進行了測定,最后評估了復合精油微膠囊對藍莓采后的保鮮效果,意在開發出一種安全環保、非接觸式抑菌型固體緩釋保鮮劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓(品種為‘巴爾德溫’,成熟度為8～9分)采自合肥徽王藍莓采摘園;檸檬醛,上海泰坦科技股份有限公司;丁香酚、肉桂醛,北京伊諾凱科技有限公司;香芹酚、百里香酚、芳樟醇、對茴香醛,上海笛柏生物科技有限公司;香葉醇、反式-2-己烯醛,上海畢得醫藥科技有限公司;壬醛,合肥優譜特生物科技有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基,南京翼飛雪生物科技有限公司;β-環糊精,上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇,西隴科學股份有限公司,以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D超凈工作臺,江蘇通凈凈化設備有限公司;DHP-9162電熱恒溫培養箱,上海一恒科技有限公司;LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠;S-4800掃描電子顯微鏡,日本日立公司;TA-XTPlus質構分析儀,英國Stable Micro Systems公司;MS2000激光粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司;85-2數顯恒溫磁力攪拌器,常州越新儀器制造有限公司;GZX-9146MBE數顯鼓風干燥箱,上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 精油抑菌率的測定

參照葛達娥[19]的方法并略作修改,采用直徑為7 mm的無菌打孔器打取培養7 d的灰霉菌塊,置于PDA培養基中央,在培養皿蓋上放置一張直徑為6 mm且滅過菌的濾紙圓片,再分別將10 μL精油滴加在濾紙片上,以無菌水作為對照。使用封口膜將培養皿密封,于28 ℃培養箱中倒置培養。培養4 d后用游標卡尺(十字交叉法)測定菌絲生長直徑,按照公式(1)計算抑菌率。根據抑菌率判定精油對灰霉菌的抑菌活性等級,即抑制率>80%、60%～80%、40%～60%與<40%分別表示強抑制作用、較強抑制作用、中等抑制作用與較弱抑制作用。

(1)

式中:Y,抑菌率,%;R0,初始菌塊直徑,mm;R1,對照組菌塊直徑,mm;R2,處理組菌塊直徑,mm。

1.3.2 精油最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)的測定

參照HERRERA等[20]的方法并做修改,采用倍比稀釋法測定精油氣相擴散下的最小抑菌濃度。用無菌打孔器(直徑7 mm)取培養7 d的灰霉菌菌塊,接種到PDA培養基中央,將直徑為6 mm的無菌濾紙片貼于培養皿皿蓋內,分別吸取10 μL不同濃度(二倍稀釋法)的精油于濾紙片上,封口膜密封,28 ℃倒置培養4 d后觀察灰霉菌生長情況。以灰霉菌完全沒有生長的最低精油濃度為精油的MIC,表示為90 mm培養皿單位體積內精油的質量,單位為mg/L。

1.3.3 具有協同抑菌作用的精油篩選方法

參照趙玲麗[21]的方法測定兩種精油聯合使用時的MIC,根據公式(2)計算不同精油聯用的分級抑菌指數(fractional inhibitory concentration,FIC)。

(2)

式中:FIC,分級抑菌指數;MICA0,精油A聯用時的最小抑菌濃度,mg/L;MICB0,精油B聯用時的最小抑菌濃度,mg/L;MICA,精油A單用時的最小抑菌濃度,mg/L;MICB,精油B單用時的最小抑菌濃度,mg/L。

兩種精油相互作用效果判定標準:FIC≤0.5時,兩種精油為協同作用;0.52時,兩種精油為拮抗作用。

1.3.4 復合精油微膠囊的制備及結構性能表征

1.3.4.1 復合精油微膠囊的制備方法

參照YANG等[22]的方法稍作修改,去離子水加熱至50 ℃,水中加入適量β-環糊精,于磁力攪拌器上攪拌至完全溶解。吸取1 mL復合精油,溶解于無水乙醇中,用針管逐滴加入β-環糊精水溶液中,密閉攪拌2 h,冷卻至室溫后,放入4 ℃冰箱沉淀24 h后抽濾,將濾渣于50 ℃烘箱中干燥12 h,即得固態復合精油微膠囊。

1.3.4.2 單因素及響應面試驗設計

以復合精油為芯材,以β-環糊精為壁材,壁芯比(g∶mL)分別為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1,包埋時間分別為1、1.5、2、2.5、3 h,包埋溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,測定復合精油微膠囊包埋率的大小。

在單因素實驗結果的基礎上,根據Box-Behnken實驗響應面設計原理,選取壁芯比(g∶mL)為6∶1、8∶1、10∶1,包埋溫度為40、50、60 ℃,包埋時間為1.5、2、2.5 h作為各因素的取值范圍進行響應面試驗,優化復合精油微膠囊的制備工藝參數。

1.3.4.3 包埋率測定

復合精油微膠囊的包埋率定義為微膠囊中的精油質量與初始添加精油質量的比值,按照公式(3)計算。

(3)

式中:EE,包埋率,%;m1,包埋后微膠囊中精油質量,mg;m0,包埋前微膠囊中精油質量,mg。

1.3.4.4 微觀結構觀察

參照趙玲麗[21]的方法,掃描電子顯微鏡下觀察微膠囊與β-環糊精形貌,放大倍數1 500倍。

1.3.4.5 粒徑測定

參照林瑩[23]的方法取微膠囊適量,加入去離子水攪拌溶解,放入激光粒徑分析儀中測量其粒徑。

1.3.4.6 釋放性能測定

稱取若干份復合精油微膠囊平鋪于培養皿內,置于冷藏(4 ℃)和常溫(20 ℃)條件下,每隔2 d取相同質量的微膠囊測定其中復合精油的質量,根據公式(4)計算復合精油微膠囊累計釋放率,每組測定重復3次。

(4)

式中:CR,累計釋放率,%;mt,微膠囊第t天復合精油的質量,mg;m0,微膠囊初始復合精油質量,mg。

1.3.4.7 復合精油微膠囊抑菌性能測定

分別稱取10、50 mg β-環糊精以及10、20、30、40、50 mg的微膠囊,于超凈工作臺內紫外殺菌30 min后加入已高溫滅菌的PDA培養基中,使其溶解,未凝固前倒入培養皿中。按照1.3.1節步驟測定灰霉菌菌斑直徑,并計算抑菌率。

1.3.5 復合精油微膠囊在藍莓保鮮上的應用

1.3.5.1 藍莓果實的處理

新鮮藍莓采后2 h內運回實驗室,預冷后選擇無病蟲害、無機械損傷,并且成熟度、形狀、大小均勻的藍莓果實,將其隨機分為2個處理組和1個對照組。2個處理組,分別加入2%與6%(以果實實際質量計)用透氣無紡布袋包裝的復合精油微膠囊粉末,置于果實底部,對照組不做任何處理。藍莓分裝在無孔包裝盒中,每盒果實150 g左右,每組設3個平行,預計6個取樣點。前2周(W)在溫度為(4±1) ℃冷庫中貯藏,每周取樣1次,2 W后轉模擬貨架20 ℃貯藏,隔2 d取樣1次。

1.3.5.2 商品率測定

商品率采用計數法測定,目測果實表皮沒有明顯的霉變、軟腐或病斑,具有商品價值的果實即為商品果實,商品率按照公式(6)計算。

(6)

式中:G,商品率,%;C,商品果實數;C0,果實總數。

1.3.5.3 霉菌總數測定

參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》,采用平板計數法計算霉菌總數。

1.3.5.4 硬度測定

將藍莓果實放置于質構儀的樣品臺上,將探頭對準果實赤道區進行穿刺測定。

1.3.5.5 可溶性固形物、可滴定酸與抗壞血酸含量測定

參照曹建康等[24]的方法測定藍莓中可溶性固形物、可滴定酸與抗壞血酸含量

1.3.6 數據分析

本研究中指標測定均重復3次,結果用平均值±標準差表示。采用Office軟件處理數據,采用SPSS 23.0軟件中ANOVA和Duncan多重比較方法進行各組間差異顯著性分析(P<0.05),采用Origin 2018軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 10種精油抑菌率的測定結果

如表1所示,10種精油在氣相擴散方式下,抑制灰霉菌生長的作用差異顯著(P<0.05),其中經檸檬醛、香芹酚、百里香酚、壬醛、反式-2-己烯醛、芳樟醇等6種精油處理后,培養基上的灰霉菌生長完全被抑制,菌落直徑仍為初始的7 mm,抑制率達到100%。說明這些精油的揮發性成分具有強抑制灰霉菌作用,因此選取這6種精油進行下一步具有協同抑菌作用的精油組合篩選實驗。

表1 十種精油對灰霉菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effects of ten essential oils on Botrytis cinerea

2.2 MIC和協同精油篩選結果

將上述6種強效精油兩兩進行復配后共有15種組合,通過測定兩種精油聯用時的MIC,結合單用時MIC值,計算出二者聯用的分級抑菌指數FIC(表2)。結果表明,其中共有9組具有相加作用,4組具有無關作用,具有協同作用的組合有2組,分別是壬醛與反式-2-己烯醛以及壬醛與香芹酚。當具有協同作用的兩種精油聯合使用時,最小抑菌濃度降低到原來的1/4(壬醛)和1/4(反式-2-己烯醛、香芹酚),即精油聯用既可達到相同的抑菌效果,又可減少精油使用量,因此選用這兩種組合的精油為芯材,以β-環糊精為壁材制備微膠囊。

表2 精油的最小抑菌濃度和聯合抑菌效果Table 2 Minimum inhibitory concentration of essential oil and combined inhibitory effect

2.3 單因素及響應面試驗分析結果

單因素試驗結果(具體結果見電子版增強出版附圖1～圖3所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034229))表明,壬醛與香芹酚復合精油組包埋率在芯壁比與包埋時間兩個單因素上優于壬醛與反式-2-己烯醛組,當壁芯比為8∶1、包埋時間為2 h、包埋溫度為50 ℃時,壬醛與香芹酚復合精油微膠囊的包埋率分別達到最高,因此選擇壬醛與香芹酚復合精油組進行響應面優化實驗[具體結果見電子版增強出版附表1～表3、圖1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034229)]。優化后的壬醛/香芹酚微膠囊最優制備條件為壁芯比8.75∶1(g∶mL),包埋溫度50.3 ℃,包埋時間2.0 h,微膠囊包埋率可達78.23%。

a-β-環糊精;b-復合精油微膠囊;c-粒徑分布

表3 復合精油微膠囊及β-環糊精對灰霉菌的抑制效果Table 3 Inhibition of compound essential oil microcapsules and β-cyclodextrin on Botrytis cinerea

2.4 復合精油微膠囊微觀結構與性能表征

2.4.1 掃描電子顯微鏡圖及粒徑分布

如圖1-a所示,空白微膠囊,即β-環糊精的結構呈不規則的塊狀或片層狀,顆粒大小隨機分布且有多處裂紋;與β-環糊精的表觀形貌截然不同,復合精油微膠囊(圖1-b)呈規則的多層立方晶體結構,大小相對均一且無明顯裂紋。掃描電鏡下觀察到的β-環糊精與復合精油微膠囊在形態與尺寸方面有明顯的區別,這表明壬醛與香芹酚復合精油與β-環糊精包合物的形成[25]。由圖1-c可看出復合精油微膠囊粒徑分布均勻,且分布范圍較窄,主要分布在1.0～70.0 μm,平均粒徑為16.86 μm。

2.4.2 復合精油微膠囊抑菌性能

如表3所示,β-環糊精對灰霉菌無抑制作用,甚至有利于灰霉菌的生長,這可能是因為β-環糊精屬于糖類物質,可作為灰霉菌的營養來源[26];而復合精油微膠囊對灰霉菌具有明顯的抑制作用并且隨著微膠囊用量的增加,抑制效果顯著提高(P<0.05),當復合精油微膠囊添加量為50 mg時,平均抑制率可達83.43%,具有強抑制作用。

2.4.3 復合精油微膠囊緩釋性能

在4 ℃與20 ℃開放空間環境下,復合精油微膠囊中的精油隨時間延長的釋放曲線如圖2所示,結果表明,兩種環境溫度下復合精油微膠囊中精油的釋放規律相似,可分為突釋、緩釋增加、趨于平緩3個階段[27]。在釋放前8 d表現為突釋,其累積釋放量分別為39.35%與44.09%,在此時間段釋放的可能是存在于β-環糊精分子間和微膠囊表面的精油。在8～24 d累積釋放量逐漸增加,這是復合精油微膠囊內部的精油在緩慢釋放,在第26天時達到最大累積釋放量,分別為50.52%和57.78%,隨后累積釋放量逐漸趨于平穩,可能是因為微膠囊內復合精油已釋放完全。復合精油微膠囊隨著貯藏時間的增加,緩釋速度先增大后逐漸趨于平緩,降低了壬醛與香芹酚的揮發且達到了緩釋作用,這與廣藿香精油微膠囊中的精油釋放規律類似[28]。這種釋放規律使得復合精油微膠囊具備長效抗菌作用,尤其前期釋放量高,可抑制采后果實初期灰霉菌的快速增殖。

圖2 復合精油微膠囊在不同溫度下的緩釋曲線Fig.2 Slow-release curves of composite essential oil microcapsules at different temperatures

2.5 復合精油微膠囊對藍莓的保鮮效果

2.5.1 商品率與霉菌總數

商品率是評價水果保鮮技術最直接、最重要的指標,由圖3-a可知,藍莓的商品率在貯藏期間都呈下降趨勢,尤其在4 ℃冷藏兩周后轉20 ℃貨架期開始,各組商品率下降速度加快,但是復合精油微膠囊處理組的商品率顯著高于空白對照組(P<0.05)。冷藏2周轉20 ℃貨架8 d后,空白對照組腐爛速率加劇,商品率僅為60%,而2%和6%微膠囊組商品率分別高達75%和84%,隨著貯藏時間延長,組間差距逐漸增大,這說明微膠囊可抑制藍莓腐爛變質。為驗證復合精油微膠囊實際抑菌性能,進一步檢測了貯藏期間藍莓果實霉菌總數(圖3-b)。結果表明,冷藏一周后,隨著貯藏時間延長對照組藍莓霉菌總數快速上升,而微膠囊處理組霉菌總數增加較緩慢,且顯著(P<0.05)低于對照組,說明微膠囊中釋放的精油能抑制霉菌的生長,降低了貯藏期間藍莓的腐爛率。在貯藏中后期微膠囊使用量越大抑菌效果越好,這與貯藏期間藍莓的商品率變化趨勢結果一致。

2.5.2 硬度、可溶性固形物、可滴定酸與抗壞血酸

藍莓果實的硬度是耐貯性的重要指標之一,由圖4-a可知,在貯藏期間各組藍莓果實的硬度都持續下降,模擬貨架20 ℃條件下相較4 ℃冷藏條件下藍莓果實硬度下降速率更快。貯藏至22 d后對照組大部分藍莓出現嚴重軟化現象,硬度僅為初始時的58%,而微膠囊處理組藍莓硬度下降較緩,6%微膠囊處理組至貯藏結束,硬度較初始僅下降約25%。復合精油微膠囊能維持藍莓硬度,這可能是微膠囊釋放出的精油抑制藍莓微生物的生長,降低藍莓果膠物質與纖維素的分解速度,維持藍莓細胞壁完整性,從而減緩了硬度的下降[29]。

a-硬度;b-可溶性固形物;c-可滴定酸;d-抗壞血酸

可溶性固形物與可滴定酸含量會影響藍莓的口感和風味,這兩個指標可用來衡量果實營養價值及判斷耐貯藏能力。在藍莓貯藏過程中,可溶性固形物含量呈現先上升后下降的趨勢(圖4-b),這與YANG[22]等在桃保鮮中可溶性固形物的變化趨勢一致,可能是因為在貯藏前期,藍莓果實中不溶性糖轉化成可溶性糖,導致可溶性固形物含量上升,在貯藏后期,由于果實的呼吸代謝作用和微生物的影響,營養物質出現損失而降低可溶性固形物含量[30]。

如圖4-c所示,各處理組藍莓果實中可滴定酸含量在貯藏過程中均呈下降趨勢,這可能是因為藍莓果實中的營養物質糖、酸等作為呼吸作用的底物被逐漸消耗,與空白對照組相比,微膠囊藍莓組中TA含量下降幅度相對較緩,表明微膠囊處理能減緩藍莓的新陳代謝,有利于維持果實的品質,延長藍莓的貯藏保鮮期。

抗壞血酸含量是反應藍莓果實品質的重要指標,隨著貯藏時間的增加,藍莓果實內營養物質逐漸被消耗,抗壞血酸含量不斷下降(圖4-d),前期4 ℃條件下降較緩,轉貨架后,下降速率加大,而且微膠囊處理組與空白對照組差距逐漸加大,差異顯著(P<0.05)。結果表明,6%復合精油微膠囊處理可較好保持果實中抗壞血酸含量,在一定程度上維持了藍莓的營養價值。

3 結論與討論

本研究通過氣相擴散法和棋盤法篩選出兩組具有協同抑制灰霉菌作用的精油組合,兩種精油聯合使用可使MIC降低至單獨使用時的1/4。以包埋率為指標,通過單因素與響應面優化實驗,確定了具有協同抑菌作用的復合精油微膠囊最佳制備工藝條件。在最優工藝條件下制備的復合精油微膠囊包埋率為78.23%,掃描電鏡下微膠囊為規則立方晶體結構,表明β-環糊精成功包封了壬醛與香芹酚。當復合精油微膠囊添加量為50 mg時,對灰霉菌的抑制率可達83.43%;在4 ℃與20 ℃環境溫度下,累積最大釋放率分別達50.52%和57.78%,具有緩釋性能,因此可應用于抑制果實采后真菌的侵染。添加量為2%、6%的復合精油微膠囊對采后藍莓均具有明顯的抑菌效果,當添加量為6%時,顯著(P<0.05)減少了藍莓果實貨架期間的霉菌總數,延緩了藍莓果實硬度、可溶性固形物、可滴定酸、抗壞血酸含量的降低從而顯著(P<0.05)提高了藍莓的商品率。因此,以壬醛與香芹酚復合精油為芯材,β-環糊精為壁材制備成微膠囊,提高了精油穩定性、緩釋性,同時掩蓋了不愉快的刺激性氣味,可以更方便、有效地應用于藍莓果實的保鮮。本研究為開發新型安全無毒、非接觸抑菌型天然固體緩釋保鮮劑提供依據,對延長采后藍莓貯藏保鮮期具有參考意義。