基于感官和化學分析技術解析不同產區醬酒風味特征

劉家歡,孫細珍,2*,熊亞青,寧珍珍,倪興婷,江莎,解倩倩

1(勁牌有限公司,湖北 黃石,435100)2(中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室,湖北 黃石,435100)

中國白酒是世界著名的六大蒸餾酒之一,其歷史悠久,早在我國西漢時期就有記載[1]。醬香型白酒是中國白酒的十二大香型之一,更是四大基本香型之一[2],其具有醬香突出、酒體醇厚、香氣幽雅、空杯留香持久的特點[3]。醬香型白酒生產過程復雜、生產周期長,經歷2次投料、9次蒸煮、8次發酵、7次餾酒[4],需要豐富的微生物環境以及高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒等特殊的工藝要求[5]。醬香型白酒的主要產區位于四川省、貴州省赤水河沿岸,以遵義市茅臺鎮產地最為著名,北方產地有承德琢酒、齊齊哈爾北大倉酒等優秀的醬酒代表[6];此外湖北省神農架地處1 100多米海拔高山,具備90%以上的森林覆蓋率,具有“暖濕、清風、富氧”的生態環境[7],形成風格獨特的醬酒產區,所產醬酒酒體干凈,回甜感良好,深受當地消費者喜愛。

不同產地具有各自獨特的氣候、菌群、水源和溫度等外界條件,雖然采用了類似的生產工藝,但不同的外界條件使得不同產地醬香型白酒擁有截然不同的風味,化學上表現為酒中微量香氣成分及其相互間的量比關系不同[8]。目前已有較多研究者對來自不同產區的醬香型白酒進行研究,張卜升等[9]利用氣相色譜-離子遷移譜聯用等技術對貴州、四川、河北和黑龍江四省產地的醬香型白酒進行研究,發現不同產地醬香型白酒間某些風味特征存在顯著差異,可以利用感官評定和氣相色譜手段進行有效鑒別,同時闡明了風味感官差異的物質基礎;李研科等[10]通過對不同產地的44個醬香型基礎酒樣品的總酸、總酯、酒精度及揮發性微量成分的測定分析得出,相同產地的微量成分含量基本一致,不同產地的微量成分含量略有差異,但是不同產地在酯類、醇類、醛類的量比關系基本一致;唐平等[11]對赤水河流域5個不同地區醬香型白酒樣品的揮發性香氣物質進行檢測分析,發現不同地區的醬香型白酒的主要香氣種類基本相似,含量差異較大,并明確了不同地區的醬香型白酒中香氣成分的分布規律。由此可見,研究不同產區醬香型白酒的風味結構特征及其差異性,對于探明其品質內涵具有重要意義。

本研究以茅臺鎮和神農架2個產區的醬香型白酒為研究對象,采用感官定量描述分析(quantitative descriptive analysis, QDA)、GC-MS、氣相色譜-嗅聞(gas chromatography-olfactometry, GC-O)、頂空-固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)等多方法聯用微量組分分析技術,剖析兩類醬香型白酒的香氣輪廓與風味特征,明晰不同產區、不同生態環境對醬酒品質的影響,增進對2個產區醬香型白酒風味獨特性的認識,為生產品質控制提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品分別由茅臺鎮酒業和神農架酒業提供,其中茅臺鎮酒業醬酒樣品共7批,編號為MTZ1～7;神農架酒業醬酒樣品共5批,編號為SNJ1～5。

實驗用化學試劑均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;定量內標(叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基己醇、異戊酸-d3、愈創木酚-d3、辛酸乙酯-d15、2-辛醇、己醛-d12、茴香基丙酮、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、糠醛-d4、二異丙基二硫醚),正構烷烴(C7～C30)及定量所用標準品,均為色譜純,購自上海安譜實驗科技股份有限公司;本實驗中所用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

Agilent 8890-5977B氣相色譜-質譜聯用儀、8890氣相色譜-氫焰離子化檢測器、DB-FFAP毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm)、HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm),美國Agilent科技有限公司;SPME三相萃取頭(2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美國Supelco公司;ODP-4型嗅聞儀、MPS-2型多功能自動進樣系統,德國Gerstel公司;Milli-Q超純水儀,美國Millipore公司;AB135-S十萬分之一電子分析天平,美國Mettler-Toledo公司;FA2004萬分之一天平,上海精密科學儀器有限公司;Flex 2純水處理系統,上海威立雅水處理技術有限公司;DC12H氮吹儀,上海安譜科技有限公司;Multi Reax渦旋振蕩儀,德國海道夫儀器公司;ZNCL-BS智能磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 感官分析

根據國際感官分析標準ISO 8586:2012 Sensory analysis-Selection and training of sensory assessors和國家標準GB/T 10345—2007《中國白酒分析方法》,由10 名專業評酒委員(6 男4 女,其中國家級評酒委員5 名,省級評酒委員5 名)組成感官評價小組,感官評估在溫度為(20±1) ℃的品評室內進行[12]。分別將20 mL醬酒樣品倒入專用白酒品嘗杯中,由所有小組成員嗅聞白酒樣品討論香氣屬性,參考文獻[13-14]篩選出糟香、醬香、糧香、花香、果香、青草香、酸香、甜香、曲香共9個香氣屬性(表1);隨后小組成員采取0～5分制(0=無氣味,1=非常弱,2=弱,3=中等,4=強,5=非常強)對9個香氣屬性的強度進行評分[15]。

表1 感官屬性、感官描述以及參比樣Table 1 Sensory attributes, sensory descriptors, and reference samples

1.3.2 香氣化合物的提取與分離

參照文獻[16]的方法對代表酒樣進行液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)處理。分別取MTZ1和SNJ1代表性醬酒樣品用超純水稀釋至酒精體積分數為10%,然后在1 000 mL分液漏斗中加入500 mL稀釋酒樣,并加入NaCl使溶液至飽和狀態,加入二氯甲烷萃取(70 mL×3);合并有機相于500 mL分液漏斗中,加入Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液(pH=10, 70 mL×3)充分振搖,使有機相和水相分離,收集有機相,記為A組;收集水相于500 mL分液漏斗中,加入HCl水溶液(4.0 mol/L)使pH=2,加入二氯甲烷萃取(70 mL×3),收集有機相,記為N組;向A、N兩組萃取液中加入無水Na2SO4于-20 ℃下干燥過夜脫水,過濾后緩慢氮吹濃縮至0.5 mL,用于GC-O和GC-MS分析。

1.3.3 GC-O及GC-MS條件

將A、N兩組萃取液分別在GC-MS上經HP-5和DB-FFAP色譜柱進行分析。采用DB-FFAP色譜柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm)分析時,升溫程序為:初溫40 ℃,以3.5 ℃/min升至220 ℃,保持10 min,再以15 ℃/min升至250 ℃;載氣(高純He≥99.999%)流速1.42 mL/min,進樣口溫度250 ℃,進樣量1 μL,不分流進樣;采用HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)分析時,升溫程序為:初溫50 ℃,保持5 min,以3.5 ℃/min升至180 ℃,以30 ℃/min升至320 ℃,保持10 min。載氣(高純He≥99.999%)流速1 mL/min,進樣口溫度280 ℃,進樣量1 μL,不分流進樣。

MS條件:電子電離源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;輔助通道加熱溫度280 ℃;掃描模式為全掃描,質量掃描范圍m/z20～500。

GC-O條件:在配有嗅聞儀的GC-MS上進行;樣品經DB-FFAP分離后按照1∶1的分流比分別進入嗅聞儀及質譜,嗅聞儀傳輸線溫度250 ℃,嗅聞口溫度200 ℃,加濕器流速50 mL/min。3 名經嗅聞訓練[17]的評價人員(1 名男性和2 名女性)對樣品進行GC-O分析,分析過程中將鼻子置于嗅聞口前,記錄色譜流出物的保留時間和香氣特征。

1.3.4 香氣化合物的定性分析

采用Masshunter軟件分析處理氣相色譜-質譜數據,采用NIST 20譜庫檢索進行初步定性;隨后使用C7～C30正構烷烴計算香氣化合物的線性保留指數,并與NIST網站中報道的保留指數進行比對,最后采用標準品對化合物的定性結果進行確認。

1.3.5 稀釋萃取分析(aroma extract dilution analysis,AEDA)

參照文獻[18]的方法將LLE得到的濃縮液在進樣分析前以2倍為稀釋倍數依次進行稀釋(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32……),隨后采用1.3.3節所述條件進樣分析,各風味物質的香氣稀釋(flavor dilution,FD)因子為GC-O分析時能被嗅覺感知到的最大稀釋倍數。

1.3.6 香氣化合物的定量分析

1.3.6.1 直接進樣技術

參照朱明等[19]的方法稍作修改,使用氣相色譜-氫火焰離子化檢測器(gas chromatography-hydrogen flame ionization detector, GC-FID)定量16種高濃度化合物(包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、異丁醇、2-戊醇、正丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇、乙醛、1,1-二乙氧基乙烷、1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷、糠醛)。取1 mL白酒樣品于2 ml進樣小瓶中,加入20 μL混合內標溶液(IS1 叔戊醇、IS2 乙酸正戊酯、IS3 2-乙基丁酸,均為16 000 mg/L),貯存于4 ℃下,供GC-FID分析。將混合標準溶液以1∶1的體積比例逐步稀釋至一系列濃度的50%乙醇水溶液中,建立標準校正曲線。所有樣品一式3份進行。

儀器條件:進樣口溫度250 ℃,載氣(高純He≥99.999%),分流進樣,分流比為30∶1;CP-WAX毛細管色譜柱,流速1 mL/min;柱溫箱升溫程序:起始溫度35 ℃,保持1 min,以3 ℃/min速率升溫至70 ℃,以3.5 ℃/min速率升溫至120 ℃,再以20 ℃/min速率升溫至190 ℃,保持2 min;FID溫度為260 ℃,H2流速30 mL/min,空氣流速350 mL/min,尾吹氣(N2)流速25 mL/min。

1.3.6.2 液液微萃取(liquid-liquid microextraction, LLME)結合GC-MS技術

參考孫細珍等[20]的方法稍作修改,使用LLME結合GC-MS技術定量白酒中酚酸類化合物,主要包括愈創木酚、4-甲基愈創木酚等7種酚類化合物,乙酸、丁酸等13種有機酸類化合物。準確吸取4 mL白酒樣品于50 mL離心管中,用超純水將樣品稀釋至體積分數為10%,然后加入NaCl使溶液飽和,接著加入20 μL混合內標溶液(IS4, 異戊酸-d3, 250 mg/L;IS5, 愈創木酚-d3, 100 mg/L),充分振搖5 min后加入2 ml乙酸乙酯,振搖5 min,超聲波處理10 min后以8 000 r/min離心10 min,靜置12 h,收集上層萃取液,向萃取液中加入無水Na2SO4干燥過夜,過濾后所得樣液用于GC-MS分析。將混合標準溶液用50%乙醇水溶液按1∶1的比例逐級稀釋,建立定量分析標準曲線。

氣相色譜條件:DB-FFAP色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度250 ℃;載氣(高純He≥99.999%),恒流模式,流速1 mL/min,進樣量1 μL,不分流進樣;升溫程序:初溫40 ℃,保持5 min,以3 ℃/min 升至240 ℃,保持5 min。

質譜條件:離子源為電子轟擊離子源(EI Xtr350),能量70 eV,溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,輔助通道加熱溫度280 ℃,溶劑延遲5 min;選擇離子模式(selected ion monitor,SIM)。

1.3.6.3 HS-SPME結合GC-MS技術

結合本實驗室早期研究[21]并稍作改進,采用HS-SPME-GC-MS方法用來定量大多數香氣化合物。以無水乙醇為溶劑配制標準品儲備液,并逐級稀釋成乙醇體積分數為10%的不同濃度梯度系列標準混合工作液,分別取系列標準工作液各8 mL于20 mL頂空瓶中,加入20 μL內標溶液(IS6,辛酸乙酯-d15,250 mg/L;IS7,2-辛醇,140 mg/L;IS8,己醛-d12,250 mg/L;IS9,茴香基丙酮,50 mg/L;IS10,2-甲氧基-3-甲基吡嗪,200 mg/L;IS11,糠醛-d4,250 mg/L;IS12,二異丙基二硫醚,2 mg/L),并加入適量NaCl使溶液飽和,蓋上頂空瓶蓋,搖勻,供HS-SPME-GC-MS分析,萃取溫度為50 ℃,萃取時間為45 min,解析時間為5 min,GC-MS條件同1.3.6.2節,以各化合物與內標物的響應值比為縱坐標,質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,酒樣按此步驟操作后進行定量分析。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 不同廠區醬酒感官分析

如圖1-a所示,曲香、糧香、青草香、甜香感官屬性在神農架與茅臺鎮醬酒之間具有顯著性差異(P<0.05),酸香和花香在2個廠區醬酒中有一定差異,而醬香、糟香、果香在2個廠區醬酒中無明顯差異。進一步采用PCA探究不同廠區醬香型白酒與感官屬性之間的關系。如圖1-b所示,PC1解釋了總方差的49.87%,PC2解釋了29.69%,前2個主成分累計方差貢獻值為79.56%,較高的方差貢獻率表明更好地包含了原始信息[22]。茅臺鎮酒和神農架酒樣品分散在坐標軸的兩側,茅臺鎮醬酒主要表現出曲香、糧香、醬香等香氣特征,而神農架醬酒則主要表現為甜香、醬香、青草香、酸香等香氣特征。

a-香氣輪廓圖;b-香氣特征PCA

2.2 不同廠區醬酒香氣化合物定性分析

為了進一步明確不同廠區醬酒間揮發性物質差異,通過GC-O-AEDA技術對兩者的香氣提取液進行分析。采用NIST譜庫檢索、保留指數、香氣特征比對,最后通過標準品確認對化合物進行定性,定性結果見電子增強出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036373)。從附表1可知,從2個廠區醬酒中共鑒定出133種FD≥2的香氣化合物,包括酯類35種、醇類16種、酸類12種、醛類化合物13種、酮類化合物9種、呋喃與內酯類13種、含氮化合物15種、酚類8種、萜烯類6種、硫化物4種、其他2種,2個廠區間醬酒的風味物質種類基本一致。

2.3 不同廠區醬酒香氣化合物定量分析

為了解析不同廠區醬香型白酒的香氣成分差異特征,對定性出的133種風味活性物質(FD因子≥2)進行準確定量分析,定量方法學參數見電子增強出版附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036373),各化合物的標準曲線線性良好,R2均大于0.99,回收率為80%～120%,各個物質的含量范圍如電子增強出版附表3(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036373)所示。

定量結果表明,乳酸丁酯、乳酸乙酯、正戊醇、γ-壬內酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪等化合物在2個廠區醬酒中存在差異,進一步采用香氣活度值(odor activity value, OAV)評估差異化合物對酒樣整體風味的貢獻大小,一般認為,OAV>1的香氣化合物對樣品具有明顯的香氣貢獻[23]。從電子增強出版附表3可知,在茅臺鎮和神農架酒樣中共有65個香氣化合物的OAV>1;其中2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、1-辛烯-3-酮、異戊酸乙酯、反,順-2,6-壬二烯醛、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、二甲基三硫、3-羥基-2-丁酮、異丁酸乙酯、3-甲基丁醛、甲硫醇、1,1-二乙氧基乙烷、2,3-丁二酮、辛酸乙酯等共14種化合物因具有較高的OAV(>100),對茅臺鎮和神農架醬酒均具有較大的香氣貢獻度,但是這些化合物在2個廠區醬酒中的含量與占比具有明顯差異。對茅臺鎮和神農架2個廠區醬酒樣品中65個的香氣活性成分的平均OAV進行比較分析,如圖2所示。

圖2 茅臺鎮和神農架醬香型白酒香氣化合物OAV比較圖Fig.2 Comparative diagram of OAV of aroma compounds in sauce-flavor Baijiu with MTZ and SNJ

從圖2可知,茅臺鎮醬酒中2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、1-辛烯-3-酮、己酸乙酯、乳酸丁酯、戊酸、苯乙酸乙酯、戊酸乙酯、苯丙酸乙酯、愈創木酚、己酸等化合物的平均OAV高于神農架酒樣;2,3-丁二酮、土味素、甲硫醇、3-羥基-2-丁酮、二甲基二硫、苯乙醛、反,順-2,6-壬二烯醛、3-甲基丁醛、1,1-二乙氧基乙烷、乙酸乙酯、1-辛烯-3-醇等化合物的平均OAV在茅臺鎮醬酒中低于神農架醬酒;其他物質在2個產區酒樣中的平均OAV差異不大。這些香氣活性成分的OAV差異可能是導致茅臺鎮和神農架酒樣之間香氣特征存在差異的原因。

2.4 不同廠區醬酒主要香氣化合物的差異分析

除了比較香氣活性成分的平均OAV外,還借助多元統計分析手段對2個廠區醬酒樣品中OAV>1的化合物進行分析挖掘[24]。利用PLS-DA對2個廠區12個樣品中香氣化合物的含量進行解析,如圖3-a所示,PLS-DA模型很好地區分2個廠區樣品,該模型的解釋變異度(R2Y)和預測能力(Q2)分別為0.989和0.970,R2Y和Q2都比較接近1,說明該模型效果較好[25]。此外為了驗證模型的可靠性,采用200次置換檢驗評估該模型是否過擬合[20]。通過置換檢驗圖(圖3-b)可以看到R2=0.776,Q2=-0.332,Q2在Y軸的截距是負值,表明該模型有效可靠。變量權重重要性排序(variable importance for the projection, VIP)表示每個變量對樣品區分的貢獻程度,一般認為VIP≥1的變量是解釋樣品差異的潛在標記化合物[26]。

a-得分圖;b-200次置換檢驗圖;c-VIP預測值分布圖

從圖3-c可知,結合OAV和VIP分析結果,茅臺鎮和神農架2個廠區醬酒間差異化合物主要包括乳酸丁酯、乳酸乙酯、γ-壬內酯等共32種。其中乳酸丁酯、乳酸乙酯、戊酸、異丁醇、苯丙酸乙酯、異戊醇、己酸、正丁醇、戊酸乙酯、2-乙基-3,5-二乙基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、苯乙酸乙酯、γ-丁內酯、正己醇、丁酸在茅臺鎮醬酒中高于神農架醬酒;γ-壬內酯、乙酸異丁酯、甲硫醇、苯乙醛、仲丁醇、2,3-丁二酮、乙酸乙酯、土味素、乙酸異戊酯、正丙醇、1-辛烯-3-醇、1,1-二乙氧基乙烷、乙醛、正己醛、丙酸乙酯、3-甲基丁醛、丙酸在神農架酒樣中高于茅臺鎮醬酒。上述差異主要由2個產區間微生態環境與特色微生物造成,其中神農架氣溫與茅臺鎮比較呈現氣溫低、晝夜溫差大的特點,神農架地區年平均氣溫較茅臺鎮低3.5 ℃;神農架晝夜溫差大,較茅臺鎮平均高3.3 ℃,環境不同,導致兩地的微生態有所區別。本實驗室研究發現神農架廠區含有一些特色的微生物,如最古老的釀酒酵母,相比而言,茅臺鎮中假絲酵母更豐富,神農架中優勢酵母為畢赤酵母、扣囊復膜孢酵母、漢遜酵母、接合酵母。

2.5 感官評價與香氣活性化合物關聯性分析

為了探究香氣活性化合物(X變量,n=65)與香氣屬性(Y變量,n=9)之間的關系,采用PLSR法建立模型探索兩者之間的關聯[24],結果如圖4所示。茅臺鎮酒樣曲香、糧香、醬香更為突出,與2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、γ-丁內酯、苯丙酸乙酯、異戊酸乙酯等物質呈正相關,這些化合物大多呈現烘焙、蘋果、甜香;而呈烘焙、醬制品香氣的甲硫醇、2,6-二乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛等物質同樣賦予神農架醬酒醬香特征,此外神農架醬酒具有愉悅的甜香、酸香,和香草醛、2,3-丁二酮、γ-壬內酯、3-羥基-2-丁酮、有機酸等物質有關,γ-壬內酯、3-羥基-2-丁酮帶來令人愉悅的杏仁、奶油、椰子等香氣,此外神農架醬酒中青草香較茅臺鎮醬酒較為突出,與乙醛、乙縮醛、己醛、異戊醛等醛類物質有關,與此同時一些呈土腥、蘑菇氣味的化合物如土味素、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮也呈正相關,上述差異與2個廠區的特征微生物具有重要關系,如神農架廠區的優勢酵母扣囊復膜酵母能夠產生一定的香氣,能產生多種甜味物質[27]。

圖4 兩個廠區醬酒香氣活性化合物與感官屬性的PLSDFig.4 PLSD between sensory attributes and aroma-active compounds of SNJ and MTZ

3 結論

基于QDA,明確了茅臺鎮醬酒和神農架醬酒的風味與感官特征差異,茅臺鎮醬酒主要表現為曲香、糧香、醬香等,而神農架醬酒則主要表現出甜香、醬香、青草香、酸香等香氣特征;通過定性與定量分析樣品中的揮發性物質,并采用CAEDA和OAV法明確了2個廠區醬酒的重要風味物質及差異性;基于PLS-DA和PLSR,明確了2個廠區醬酒間的32個差異貢獻物質,以及感官特征與風味物質間的關聯性,影響茅臺鎮醬酒感官特征的重要香氣物質主要包括2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、γ-丁內酯、苯丙酸乙酯、異戊酸乙酯;而與神農架醬酒特定感官特征相關的重要香氣物質主要包括甲硫醇、2,6-二乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛、香草醛、2,3-丁二酮、γ-壬內酯、3-羥基-2-丁酮、乙醛、乙縮醛、己醛、異戊醛。本實驗通過感官分析和化學分析相結合的方式對茅臺鎮和神農架醬酒的感官特征與風味物質差異進行研究,為研究不同廠區醬酒差異提供案例及參考,同時增進了對茅臺鎮和神農架醬酒風味獨特性的認識,明確了生態環境與微生物群落差異對醬酒風味的影響,為醬酒生產品質控制提供了參考和理論依據。