虎奶菌菌核及其發酵菌絲體中的成分比較

郭斌,秦新政,王慊,樊永紅*

1(新疆大學 生命科學與技術學院,新疆生物資源基因工程重點實驗室,新疆 烏魯木齊,830046)2(新疆農業科學院 微生物應用研究所,新疆 烏魯木齊,830091)

虎奶菌(Pleurotustuber-rigium(Fr.) Sing),又名虎奶菇、菌核側耳等,其隸屬于擔子菌亞門、側耳科、側耳屬[1]?；⒛叹鷱V泛分布于世界熱帶和亞熱帶地區,包括非洲、亞洲、澳大拉西亞[2],我國早在1995年從尼日利亞引進栽培,目前在我國主要分布在緯度較低區域,如云南騰沖和章鳳市[3-4]。

虎奶菌是典型的真菌單倍體,其能夠通過無性及有性的方式繁殖[5],虎奶菌生長過程不同于其他側耳屬菇類,它在發育階段具有菌核(一種地下莖塊)和長柄杯狀子實體,虎奶菌是已知的唯一一種利用菌核產生子實體的菇類[6]。這種球形菌核是一種能量儲存器官,能夠在干旱時期存活,在不利的生長情況下可以產生新的子實體[7],虎奶菌菌核與子實體均可食用,且具有藥用價值[8-9]。在相關研究報道中虎奶菌被非洲當地草藥醫生用于治療各種疾病,包括心臟灼燒、胃潰瘍、哮喘、高血壓,甚至乳腺癌等。近年來,證明虎奶菌在功能性食品、化妝品和藥品中具有潛在價值的科學證據正在出現?；⒛叹芯哂卸喾N化學成分,其中富含具有生物活性的β-葡聚糖組成的非淀粉多糖,這些多糖有著非常重要的藥理作用[10]?；⒛叹訉嶓w中超過一半營養成分被鑒定為碳水化合物,其次是蛋白質,脂肪和蛋白質的含量相對較低,同時在虎奶菌中含有大量的礦物質元素,例如鉀、鈣、鈉、鎂、鋅、銅等,此外,虎奶菌中有豐富的活性成分,如多糖、生物堿、酚類化合物、鞣質、黃酮類化合物等[11]。

傳統上,虎奶菌的有效成分主要是從菌核中提取的[12-13],但人工栽培虎奶菌具有周期長和成本價格高的缺點,提取具有治療和保健的有效成分不可避免地會花費太多成本。因此,對虎奶菌的開發和利用也會受到限制,采用液體深層次發酵可在短時間獲得大量菌絲體和發酵產物[14]。與此同時,相關研究表明菌絲體的營養價值在多糖、蛋白質、氨基酸含量方面接近或超過子實體[15-16]。本研究對虎奶菌菌核和液體發酵菌絲體的常規營養成分如氨基酸、脂肪酸和微量元素的組成以及活性成分多糖、多酚、三萜、黃酮等組分含量進行對比分析和評價,進一步完善了虎奶菌菌核和菌絲體中有效成分的信息,為其質量的綜合評價提供科學數據。同時,也為該菌的研究提供理論和實踐依據,在功能食品和制藥行業中提取有效成分將大大降低成本,為虎奶菌的應用奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎奶菌菌株由烏魯木齊食用菌研究所采集、鑒定、馴化所得;虎奶菌菌核由烏魯木齊食用菌研究所栽培提供。

1.2 培養基

種子培養液:PDB培養基。

發酵培養液(g/L):葡萄糖30、酵母浸粉4、KH2PO41、MgSO40.6。

1.3 儀器與設備

KDN-1凱式定氮儀,上海雷茲公司;SZC-1脂肪測定儀,上海纖檢儀器有限公司;UV-2450紫外-可見分光光度計,日本島津公司;SpectraMax M酶標儀,美谷分子儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌絲體發酵

將生長旺盛的虎奶菌菌株接種至種子培養液中,設定搖床條件為30 ℃、180 r/min,培養3 d,種子液接種量為5%,30 ℃、180 r/min,培養7 d,過濾、沖洗菌絲體。將收集得到的菌絲體與菌核放置在60 ℃烘箱中,熱風干燥至恒重,粉碎、過篩備用。

1.4.2 常規營養成分測定

根據GB 5009.3—2010《食品安全國家標準 食品中水分的測定》測定樣品中水分含量;根據GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》測定樣品中灰分含量;根據GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》測定樣品中脂肪含量;根據GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》測定樣品中蛋白質含量;根據GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》測定樣品中總糖含量;根據GB 5009.8—2023《食品安全國家標準 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》利用高效液相方法測定果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的含量;根據GB 5009.86—2016《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》利用高效液相色譜測定維生素C的含量;根據GB 5009.157—2016《食品安全國家標準 食品中有機酸的測定》利用高效液相色譜測定有機酸含量。

1.4.3 氨基酸含量測定

樣品處理:除色氨酸外剩余17種氨基酸酸解,稱取0.1 g樣品于密封瓶中,加入10 mL 6 mol/L鹽酸(含1%苯酚),充N21 min,封瓶,110 ℃水解22 h。取出冷卻,加水稀釋定容至50 mL,取1 mL 95 ℃下氮吹揮干,準確加入1 mL 0.01 mol/L HCl溶液溶解,過0.2 μm水系濾膜,上機分析。

色氨酸采用堿解方法,稱取粉末0.05 g樣品于密封瓶中,加5 mL 5 mol/L NaOH溶液,110 ℃水解20 h,取出冷卻,加水定容至10 mL。取2 mL,用2.5 mol/L HCl溶液調節pH 7,定容至5 mL,過0.2 μm水系濾膜,上機分析。

色譜條件:Agilent 1100液相色譜儀(配VWD檢測器)ZORBAX Eclipse AAA (4.6 mm×150 mm, 3.5 μm);檢測信號:紫外338 nm (0～19 min),266 nm (19.01～25 min);流動相A:40 mmol/L磷酸二氫鈉(pH 7.8);流動相B:V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10;流速:1.0 mL/min。流動相梯度洗脫比例詳見表1。

表1 梯度洗脫過程Table 1 Gradient elution program table

1.4.4 脂肪酸含量測定

油脂提取:參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》操作進行水解-提取法。

脂肪酸的甲酯化:稱取油脂,油脂中加入2 mL 140 g/L三氟化硼-甲醇,60 ℃水浴30 min進行甲酯化,冷卻至室溫,加入1 mL蒸餾水和2 mL正己烷振蕩,靜置分層完全后吸取上層有機層,N2吹揮干溶劑后用1 mL正己烷溶解,樣品上GC/MS分析。

脂肪酸的GC/MS分析

色譜條件:色譜柱HP-5MS(60 m×0.25 mm,0.25 μm);進樣口溫度280 ℃;進樣量1.0 μL,分流比20∶1;載氣氦氣;恒線速度流速1.5 mL/min;升溫程序初始柱溫120 ℃,保持1 min;以6 ℃/min速率升到170 ℃,保持0 min;再以2.5 ℃/min速率升到215 ℃,保持12 min;以4 ℃/min速率升到230 ℃,保持10 min;以10 ℃/min速率升到280 ℃,保持15 min。

質譜條件:離子源溫度200 ℃;四級桿150 ℃;連接線溫度260 ℃;電子轟擊能量70 eV;質量掃描范圍m/z40～550。

1.4.5 礦物質元素含量測定

采用原子吸收分光光度計測定試樣的各種元素含量。其中Cu、Fe、Ca、K、Mg、Zn采用火焰法,Mo、Se采用石墨爐法。稱量0.5 g試樣于50 mL消解罐中,加入10 mL的硝酸,蓋上蓋子,消解溫度170 ℃,保持時間15 min的消解儀中消解。待消解結束之后,取出消解罐,置于通風櫥中冷卻至室溫,打開氣蓋,在140 ℃條件下進行趕酸,在趕酸的過程中每隔20 min搖動1次消解罐,等到消解液為2～3 mL時全量轉移出罐內的消解液,用超純水清洗管內壁2次,收集所有溶液,定容至20 mL?；鹧娣ㄔ睾坑嬎闳绻?1)所示、石墨爐法元素含量的計算如公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:ρ,試樣溶液元素含量,mg/L;ρck,空白對照中元素含量,mg/L;V,消解液定容體積,mL;N,稀釋倍數;m,樣品質量,g。

1.4.6 多糖含量測定

虎奶菌菌絲體與菌核多糖按照NY/T 1676—2023《食用菌中粗多糖的測定 分光光度法》計算菌絲體和菌核中總多糖,結果以葡萄糖當量表示,標準曲線方程為y1=11.168x1+0.010 2,R2=0.999 5。

1.4.7 三萜含量測定

按照NY/T 3676—2020《靈芝中總三萜含量的測定 分光光度法》測定總三萜的含量,三萜類化合物在酸性條件下與香草醛反應生成藍紫色產物,結果以齊墩果酸當量表示,標準曲線方程為y2=18.887x2-0.011 6,R2=0.999。

1.4.8 多酚含量測定

參照MARSOUL等[17]實驗方法,稍作修改,稱取沒食子酸粉末,蒸餾水溶解、定容質量濃度為0.001 g/mL。吸取0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL沒食子酸溶液于25 mL容量瓶中,加入福林酚試劑1 mL,振蕩搖勻后靜置3 min,加入120 g/L的Na2CO3溶液2 mL,定容后室溫、無光條件下存放2 h。結果以沒食子酸當量表示,標準曲線方程為y3=0.515 5x3+0.019 7,R2=0.997 8。

1.4.9 黃酮含量測定

黃酮含量參照植物類黃酮試劑盒進行測定,其測定原理為在堿性亞硝酸鹽溶液中,類黃酮與Al3+反應能夠形成紅色絡合物,在510 nm處有特征吸收峰。通過測定510 nm吸光值,即可計算樣品類黃酮含量。

1.4.10 組分測定

稱取1 g經干燥粉碎處理的菌絲體和菌核樣品,加入1 mL去離子水潤濕樣品,加入10 mL甲醇,振蕩混勻后超聲波處理20 min,4 000 r/min離心5 min除去殘渣,上清液經0.22 μm濾膜過濾后,進樣體積1 μL,用GC-MS分析。

GC條件:SHIMADZU SH-Rxi-5Sil MS色譜(30 m×0.25 mm×0.25 μm);分流進樣,分流比10∶1;程序升溫:進樣口溫度250 ℃,初始溫度30 ℃,保持1 min,以5 ℃/min升至250 ℃,保持3 min,再以10 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

MS條件:EI電離源;載氣為He;吹掃流量3 mL/min;電子能量70 eV;離子源溫度200 ℃;全掃描模式,質量掃描范圍35～600 amu;溶劑延遲2 min。

2 結果與分析

2.1 主要營養成分分析

圖1為虎奶菌菌絲體與菌核的主要營養成分,其中圖1-a表示為灰分、粗蛋白、粗脂肪等營養成分含量,圖1-b表示為單雙糖組成,由圖1-a可知,菌絲體水分含量、總糖含量、粗脂肪含量顯著(P<0.05)低于菌核,菌絲體與菌核的灰分含量差異不顯著(P>0.05),菌絲體粗蛋白含量顯著(P<0.05)高于菌核,均具有統計學意義。通過高效液相色譜法測定菌絲體與菌核中單雙糖組成如圖1-b所示,菌絲體中共檢測到2種單糖和1種雙糖,分別是果糖3.29 g/100 g、葡萄糖4.71 g/100 g和乳糖2.59 g/100 g;菌核中共檢測到2種單糖和3種雙糖,分別為果糖3.39 g/100 g、葡萄糖2.80 g/100 g、蔗糖2.44 g/100 g、麥芽糖2.80 g/100 g和乳糖2.61 g/100 g。在菌絲體與菌核中,菌絲體中葡萄糖含量高于菌核,果糖和乳糖含量結果基本一致。

a-營養成分;b-單雙糖組成

2.2 有機酸含量分析

由表2可知,虎奶菌菌絲體中共檢測出2種有機酸,分別為蘋果酸1.08 mg/kg和丁二酸30.14 mg/kg,菌核中共檢測出4種有機酸,分別為蘋果酸1.00 mg/kg、丁二酸11.41 mg/kg、富馬酸0.06 mg/kg和己二酸9.30 mg/kg,通過對比研究發現,菌絲體和菌核中都含有蘋果酸和丁二酸,菌絲體中丁二酸含量為菌核3倍。丁二酸又名琥珀酸,當存在Na+時能形成琥珀酸鈉,琥珀酸及其鈉鹽均有鮮味,可用于調味料。

表2 虎奶菌菌絲體和菌核中有機酸的含量 單位:mg/kg

2.3 維生素C含量分析

維生素C是人體中不可或缺的一種營養成分,當缺乏維生素C時,存在于組織中的膠原質會變得不穩定從而無法發揮其正常功能。通過近些年的研究表明,食用菌中含有豐富的維生素C,所以通過不同的手段及方法探討定量分析食用菌中維生素C含量具有一定的實用價值。從表3中可以看出在虎奶菌菌絲體與菌核中維生素C含量差異顯著(P<0.05),菌核中維生素C含量顯著高于菌絲體,其中菌絲體中維生素C總量為64.40 mg/100 g;菌核中維生素C總量為146.52 mg/100 g。

表3 虎奶菌菌絲體和菌核中維生素C的含量 單位:mg/100 g

2.4 氨基酸組成分析及評價

虎奶菌菌絲體和菌核中氨基酸組成結果如電子版增強出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036309),在虎奶菌菌絲體與菌核中均檢測出18種氨基酸,菌絲體的總氨基酸(total amino acids,TAA)含量為5.226 9 mg/g,其中必需氨基酸(essential amino-acid,EAA)含量為1.20 mg/g,占總氨基酸的22.95%;菌核的TAA含量為1.667 3 mg/g,EAA含量為0.395 1 mg/g,占總氨基酸的23.69%;菌絲體與菌核的EAA/非必需氨基酸(non-essential amino acid,NEAA)比值分別為29.77%和31.05%。菌絲體與菌核中均含有8種必需氨基酸和10種非必需氨基酸,在菌絲體中蘇氨酸含量最高,在菌核中亮氨酸含量最高,與此同時,菌絲體的必需氨基酸和非必需氨基酸總含量均高于菌核。

2.5 脂肪酸組成及分析

不飽和脂肪酸與人體生理機能相關,是目前脂肪酸代謝研究的一個重點。研究表明,科學食用和合理攝取脂肪酸起到預防、減輕疾病的作用,脂肪酸是人體健康密切相關,必不可缺少的營養養分之一[18]。由電子版增強出版附表2結果分析可知,虎奶菌菌絲體中共檢出11種脂肪酸,其中不飽和脂肪酸為0.137 6 g/100 g,相對含量占總檢出量58.61%;飽和脂肪酸為0.097 g/100 g,相對含量占總檢出量41.38%。由電子版增強出版附表3結果分析可知,虎奶菌菌核中共檢出26種脂肪酸,其中不飽和脂肪酸為2.99 g/100 g,相對含量占總檢出量86.20%;飽和脂肪酸為0.479 1 g/100 g,相對含量占總檢出量13.80%。通過電子版增強出版附表2和附表3對比分析可知,在虎奶菌菌絲體與菌核中的脂肪酸主要為不飽和脂肪酸,并且在虎奶菌菌核中不飽和脂肪酸含量高于菌絲體。其中在菌絲體中脂肪酸以亞油酸為主,其次為油酸,菌核中主要以亞麻酸為主,其次為亞油酸,油酸和亞油酸是已知的兩種對人體有益的長鏈不飽和脂肪酸。

2.6 礦物質元素分析

礦物質元素在人體、動物和植物體內具有重要的作用,是構成骨骼、血紅蛋白,維持神經、肌肉正常功能,抵抗疾病、促進生長發育的基礎。礦物質元素不能由人體自行合成,通常是來自食物和各種外源性物質中,微量元素在人體生命過程中有著極其重要的作用。由表4可知虎奶菌菌絲體與菌核中礦物質元素較為豐富,含對人體有益的K、Ca、Mg常量元素以及人體必需的Zn、Fe、Mn、Cu、Mo、Se微量元素,在菌絲體中常量元素依次為K、Mg、Ca,微量元素依次為Zn、Fe、Cu、Mo、Se;菌核中常量元素依次為K、Ca、Mg,微量元素依次為Fe、Zn、Cu、Mo、Se?？傮w而言,K在菌絲體和菌核中含量均最高,分別高達984.6 mg/100 g、1 276.1 mg/100 g,K能夠幫助維持人體神經系統的發育,從而使注意力和學習力都有提高。Se的含量最低,分別是0.3 μg/100 g、1.0 μg/100 g?；⒛叹z體和菌核中礦物質元素在含量上呈現差異顯著(P<0.05),其中菌絲體中Zn元素顯著(P<0.05)高于菌核的元素含量,而其他元素含量菌核均顯著(P<0.05)高于菌絲體。

表4 虎奶菌菌絲體和菌核中礦物質元素的含量Table 4 The contents of mineral elements in the mycelium and sclerotia of Pleurotus tuber-rigium

2.7 活性成分分析

虎奶菌菌絲體和菌核中均含有多糖、多酚、三萜和黃酮活性成分結果如圖2所示,菌絲體中多糖、多酚、三萜、黃酮含量分別為3.23、1.2、1.94、1.12 mg/g;菌核中多糖、多酚、三萜、黃酮含量分別為4.01、1.6、2.55、1.23 mg/g。通過對比研究發現虎奶菌菌核中三萜、多糖、多酚含量顯著(P<0.05)高于菌絲體,菌絲體與菌核中黃酮含量差異不顯著(P>0.05)。

圖2 虎奶菌菌絲體與菌核中活性成分的含量Fig.2 The contents of active ingredients in the mycelium and sclerotia of Pleurotus tuber-rigium

2.8 GC-MS組分分析

圖3是虎奶菌菌絲體GC-MS總離子流圖。通過NIST質譜圖庫鑒定在虎奶菌菌絲體中共檢測出32種化合物,其中亞麻酸甲酯(34.08%)、亞油酸(22.04%)、二十烯酸(10.08%)和5-羥甲基二氫呋喃-2酮(5.09%)是相對含量較多的化合物。檢測出化合物主要是酸類(37.51%)、酯類(35.77%)、酮類(14.15%),占到了檢出總化合物的87.43%。

圖3 虎奶菌菌絲體GC-MS總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion flow diagram of Pleurotus tuber-rigium mycelium

圖4是虎奶菌菌核GC-MS總離子流圖。通過NIST質譜圖庫鑒定虎奶菌菌核中共檢測出18種化合物,其中亞麻酸(22%)、丙三醇(18.88%)、硬脂酸(10.27%)是相對含量較多的化合物。檢測出化合物主要是酸類(52.31%)、醇類(18.88%)、酯類(5.86%)、酮類(5.02%),占到了檢出總化合物的82.07%。

圖4 虎奶菌菌核GC-MS總離子流圖Fig.4 GC-MS total ion flow diagram of the nucleus of Pleurotus tuber-rigium sclerotia

2.9 虎奶菌菌絲體與菌核GC-MS結果的比較

由電子版增強出版附表4可知,虎奶菌菌絲體與菌核中共同含有的化合物有5種,分別為亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、亞麻酸甲酯、2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮。說明這5種化合物能夠在虎奶菌生長的過程中穩定存在,占主導地位。在虎奶菌菌絲體中主要化合物分別為亞麻酸甲酯、亞油酸、二十碳烯酸、5-羥甲基二氫呋喃-2-酮,菌核中主要為亞麻酸、丙三醇、硬脂酸。通過對比發現菌絲體和菌核的化合物均以不飽和脂肪酸為主,高比例的不飽和脂肪酸對維持機體健康具有重要作用[18]。其中菌絲體中亞麻酸甲酯含量最多,其次為亞油酸,菌核中亞麻酸含量最多,這與前期脂肪酸含量結果基本一致。2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮的相對含量在菌絲體中高于菌核,2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮是一種美拉德反應的中間體之一,能夠有效調控美拉德反應[19]。與此同時,該化合物具有較強的抗氧化活性,對于宮頸癌的預防和治療具有潛在的應用價值[20-22]。

虎奶菌菌絲體酯類和酮類化合物的相對含量高于菌核,而酸類和醇類化合物的含量菌核高于菌絲體,且菌絲體中的化合物類別多于菌核。酮類化合物具有保護腎臟、抵抗肺損傷、鎮痛消炎的作用[23],酯類化合物能夠產生特殊的揮發性香氣,例如果香味、燒焦味、香酯味等[24]。醇類化合物能夠降低膽固醇的含量,減少心腦血管疾病的發生[25]。

3 結論

虎奶菌菌絲體和菌核中均具有豐富的營養成分,總糖、粗脂肪、脂肪酸、維生素C含量在菌核中高于菌絲體,而氨基酸、蛋白質含量在菌絲體中高于菌核,菌核中具有較為豐富的有機酸。這表明虎奶菌菌絲體是一種低脂肪、高蛋白質的營養來源。在虎奶菌菌絲體和菌核中同樣含有豐富的礦物質元素,K、Mg、Fe、Zn含量均較高,其中菌絲體中Zn的含量高于菌核,研究表明Zn能夠幫助兒童智力發育?；⒛叹z體與菌核中均以不飽和脂肪酸占主導地位,且主要為多不飽和脂肪酸,其中菌絲體中以亞油酸為主,其次為油酸,菌核中主要以亞麻酸為主,其次為亞油酸,油酸和亞油酸是2種對人體非常有益的長鏈不飽和脂肪酸。在虎奶菌菌絲體和菌核活性成分中,多糖、三萜、多酚的含量在菌核中均高于菌絲體,而黃酮含量在菌絲體和菌核中含量基本相同。

虎奶菌菌絲體和菌核中的組分主要由酸類、酯類和酮類化合物構成。菌絲體中主要化合物分別為亞麻酸甲酯、亞油酸、二十碳烯酸、5-羥甲基二氫呋喃-2-酮,菌核中主要為亞麻酸、丙三醇、硬脂酸。通過對比研究發現,菌絲體和菌核中的化合物均以不飽和脂肪酸為主,目前較多的研究結果表明多不飽和脂肪酸具有如降低血脂、抗氧化等多種生物活性。菌絲體和菌核中具有豐富的組成成分,這些成分能夠使虎奶菌具有特殊的揮發性香氣。

綜上,通過本研究發現虎奶菌菌絲體和菌核中均含有豐富的營養成分和活性成分及組成成分。與菌核相比,各成分在菌絲體中具有差異性,但部分成分在菌絲體中與菌核相似甚至更高,這說明虎奶菌液體發酵菌絲體同樣具有較高的營養價值和一定開發價值,同時多成分分析檢測及差異性比較可為虎奶菌進一步功能食品的開發提供參考依據。