有機溶劑體系中癸酸甘油酯的酶法合成

李 論

(江蘇省淮安質量技術監督局,江蘇淮安 223001)

有機溶劑體系中癸酸甘油酯的酶法合成

李 論

(江蘇省淮安質量技術監督局,江蘇淮安 223001)

從最常用的有機溶劑體系著手,進行了有機溶劑體系中脂肪酶催化辛酸與甘油酯化制備功能性中鏈甘油酯的研究,探討酶量、反應時間、反應溫度、底物比率等對反應的影響。

有機溶劑;癸酸甘油酯;酶法合成

目前,用于酶促反應的非水介質主要包括:①與水混溶的有機溶劑和水形成的均一體系;②水與有機溶劑形成的兩相或多相體系;③含微量水的有機溶劑;④超臨界流體;⑤反相膠束;⑥無溶劑體系;⑦離子液[1]。超臨界流體和離子液是兩種綠色反應介質,其在脂肪酶催化反應方面的應用也有報道[2-3];但其作為一種反應介質在油脂改良方面的研究報道卻非常少。目前在甘油酯的合成中,應用最多的是含微量水的有機溶劑體系和無溶劑體系。

1 材料和方法

1.1 材料

固定化脂肪酶(Lipozyme,來自Candida rugosa)、癸酸、癸酸甘油單酯,癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯均購自Sigma-Aldrich公司(Steinhe im,Germany)。甘油和其他試劑為分析純或色譜純。

1.2 酯化反應

將3.0mmol癸酸、1.0mmol甘油加入到裝有3mL正己烷的10 mL帶螺旋蓋的玻璃試管中,旋緊蓋子,在反應溫度下預熱使反應物溶解并混合均勻,然后加入50.0 mg固定化脂肪酶。反應混合物在40℃旋轉水浴鍋中以150 r/min的轉速反應24 h。加入3.5 mL乙醇/丙酮(1∶1,體積比)終止該反應。采用乙酸銅法測定反應混合物中剩余的游離脂肪酸量。每次測定的百分比轉化率表示為消耗癸酸物質的量占起始癸酸物質的量的百分比。

1.3 產品組成的鑒定

酯化反應在最佳的反應條件下進行。最佳反應條件為:溫度,40℃;時間24h;底物物質的量比2.5;脂肪酶100.0 mg。反應結束后,反應混合物通過無水硫酸鈉柱子除掉水分和脂肪酶。用薄層層析法對反應混合物進行分離(GF254硅膠板,厚度1 mm,20 cm×20 cm),展開劑為氯仿∶丙酮(9.5∶0.5,體積比)。

1.4 產物的液相色譜(HPLC)分析

丙酮作為溶解樣品的溶劑,取10μL樣品進行HPLC分析。HPLC系統為美國Agilent公司儀器,配有R I檢測器和ODS-C18色譜柱(5μm,4.6 mm×250 mm,Agilent),以乙腈∶乙酸(94∶6,體積比)作為洗脫溶劑,采用梯度洗脫。梯度程序為:起始洗脫劑流速1 mL/min,保持7 min,然后在1 min內線性增加到2 mL/min,保持8 min,最后在1 min內線性降到1 mL/min,保持3 min。

2 結果與討論

2.1 時間對酯化反應的影響

在酶催化反應中,要以最低的生產費用獲得最高產物量,反應時間是確定最佳反應條件中必需研究的一個關鍵因素。隨著反應時間的延長,轉化率增加。尤其在0～16 h之間,酯化初始速率增加很快,超過16 h后,轉化率的增長速度較慢。

2.2 有機溶劑對酯化反應的影響

當酶懸浮于有機溶劑中時,酶構象的改變導致其底物專一性、立體選擇性的改變和穩定性的提高。有機溶劑的極性對于酶的催化活性至關重要,因為它影響著酶表層結合水的多少。在癸酸與甘油的酯化反應中,為了選擇出一種適宜的有機溶劑作為反應介質,對不同的lgP值的有機溶劑:丙酮(lgP=-0.23)、乙酸乙酯(lgP=0.68)、氯仿(lgP=2.0)、正己烷(lgP=3.5)、正庚烷(lgP=4.00)、異辛烷(lgP=4.2)、正辛烷(lgP=4.5)、正癸烷(lgP=5.60)進行了研究。脂肪酶在正己烷、異辛烷、正辛烷和正庚烷等非極性有機溶劑中比極性有機溶劑表現更活躍。lgP(給定溶劑在水和正辛醇中的分配系數)>2.00的非極性有機溶劑被證明是最合適的溶劑。本研究結果表明,正己烷和異辛烷是Lipozyme催化癸酸與甘油酯化反應的最佳溶劑。

2.3 底物物質的量比對酯化反應的影響

在酶催化的反應中,底物比率對酶的催化活性有很大的影響。在本研究中,保持癸酸的量不變(3 mmol),同時改變辛酸的量(0～30 mmol),希望能以最佳的底物比率獲得最大轉化率。從理論上講,高的底物比率應該使反應向產物方向移動,癸酸轉化率也相應提高,但事實并非如此。最佳的癸酸甘油物質的量比為2.5,超過此比例,轉化率沒有提高,反而下降。反應混合物中的甘油過剩抑制了酶的活性。過量甘油導致大量的酶溶解在甘油中,從而降低了界面脂肪酶濃度,可能降低反應速率。

2.4 酶量對酯化反應的影響

在酶催化反應中,酶量也是一個關鍵的因子。它決定著反應進程的快慢。在一定條件下加大酶量,可以加快反應速度,提高產物轉化率。隨著脂肪酶量增加,MCG的合成量也增加。當脂肪酶超過100.0 mg時,MCG的產量沒有顯著增長。酶量的不斷增大可以提高酯化反應的進程,但逆反應進程同時也加快。另外,過高的酶量還會帶入體系過多的水分,而且酯化反應本身就會形成一定量的水,因此隨酶量增加,水解副反應發生的進程也會加快。故過高酶量并不一定有利于產物產量的提高。

2.5 初始水活度(aw)對酯化反應的影響

酶需要少量的水維持其活性的三維構象狀態,即使是共價鍵鍵合到一個支持物上的酶也不例外。水影響蛋白質結構的完整性、活性位點的極性和穩定性。酶周圍水的存在,能降低酶分子的極性氨基酸的相互作用,防止產生不正當的構象結構?？刂扑只疃葘τ谥久赴l揮催化活性非常重要。在一定范圍內,隨著水分增加酶活性也逐漸提高,但水分過多又會導致酶活性的降低和甘油三酯的水解。因此對于一個特定的反應,必須確定其最適水量。

2.6 溫度對酯化反應的影響

反應溫度是酶促反應中的一個重要的因子。反應溫度對癸酸/甘油酯化反應的影響:在10～60℃之間,癸酸轉化率變化比較大,溫度比較低時,隨溫度升高其轉化率也提高,50℃時其轉化率達到最高,但40～50℃之間沒有明顯的變化,當反應溫度超過50℃時,癸酸轉化率急劇降低。對于吸熱反應而言,高溫使熱力學平衡向產物方向移動,有利于產物產量的提高。本研究中,反應在有機溶劑體系中進行,不存在底物溶解性問題,反應體系的黏度問題也不存在。因此可以避免使用過高的反應溫度。

2.7 產品組成分析

分析產品混合物的典型液相色譜發現,剩余游離癸酸物質的量比為18.31%,有81.69%的癸酸轉化為MCG。在產品中癸酸甘油單酯、癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯的百分比分別為8.60%、35.18%和56.22%。結果表明,來源于C.rugosa的脂肪酶可被用于生產癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯。

3 結論

本文以來源于Candida rugosa的脂肪酶作為催化劑,進行了有機溶劑中酶促癸酸和甘油酯化合成中鏈甘油酯的研究?？疾炝嗣噶?、底物比率、反應時間、有機溶劑和水分活度對反應的影響。結果表明最佳反應條件為:溫度,40℃;時間,24 h;底物物質的量比2.5;酶量100 mg。反應中所用的有機溶劑對酶的催化活性有極大的影響,一般而言,在logP為3.5～4.0的非極性有機溶劑中,脂肪酶的催化活性比較高。在起始水分活度aw為0.33時,可以獲得最大產物產率。對最終反應產物進行HPLC分析表明,來源于Candida rugosa的脂肪酶有利于癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯的催化合成,而癸酸甘油單酯的合成催化能力比較差。

[1］Krishna S H.Developments and trends in enzyme catalysis in nonconventional media[J].Biotechnology Advances,2002,20:239-267

[2］Oliviera J V,Oliviera D.Kinetics of the enzymatic alcoholysis of palm kernel oil in supercritical CO2[J].Int Eng Chem Res,2000,39(12):4450.

[3］MillerD A,Blanch H W,Prausnitz J M.Enzymatic interesterification of triglycerides in supercritical carbondioxide[J].AnalN YAcad Sci,1990,613:534.

TQ225.242

A

1003-3467(2010)18-0030-02

2010-07-21

李 論(1973-),男,工程師,主要從事技術管理工作,電話:13705238812。