PAMAM-D對異種移植用外源基因轉染豬精子細胞介導作用的研究*

楊惠祥 喬寶民 王廣有 李勝芝 張 玥 李長平 徐 勇 馬騰驤

豬是異種移植器官供體的首選動物，將人補體調節蛋白基因包括人衰變加速因子（human decay accelerating factor，hDAF）基因轉移到豬體內是克服超急排斥反應的有效方法[1]。目前常用受精卵顯微注射法培育轉基因動物，但存在設備昂貴、技術復雜、效率低等缺陷。應用精子載體法（SMGT）進行基因轉移制備轉基因動物方法簡便，成本低，便于規模生產[2]。由于SMGT轉基因的隨機性較強，其轉染效率的穩定性還有待提高。近年來，在基因治療領域，利用新型納米材料聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物PAMAM－D進行基因轉移獲得了成功[3]。本文嘗試將PAMAM-D/hDAF復合物與豬精子共孵育，以提高外源基因hDAF對豬精子細胞的轉染效率和穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）hDAF基因重組質粒（以hDAF cDNA表示）由天津市泌尿外科研究所構建完成[4]，抽提純化后加入內切酶SacⅠ使其線性化，末端為黏性末端，工作液濃度為100 mg/L。（2）豬精液采自天津天泰公司豬場1～1.5歲的長白雜交種豬，利用手握法采集含精子豐富的精液部分，距離實驗時間不超過3 h，精液按照1∶10的比例稀釋于37℃預熱的豬授精培養基/牛血清白蛋白（SFM/BSA）液中，保存于17℃。（3）主要試劑：PAMAM-D（G5）由南開大學生物活性材料教育部重點實驗室孔德領教授惠贈，SFM和SFM/BSA液的制備見參考文獻[2]（試劑均為Sigma公司產品），DNA探針/原位雜交檢測試劑盒（生物素標記探針，北京鼎國公司），DNaseⅠ和限制性內切酶 SacⅠ、XbaⅠ、ClaⅠ(大連寶生物公司)。3′尾段標記生物素的寡核苷酸DNA探針，序列為5′-GATTTTCCTCTGCATTCAGGTGGTG GGC-3′，由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PAMAM-D/DNA復合物的制備 100 μL SFM液中分別加入線狀 hDAF cDNA 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg，每組 cDNA再按氮磷比 10∶1、20∶1、40∶1 分別加入相應劑量 PAMAM-D及不加PAMAM-D，輕輕混合后室溫下孵育30 min，形成的各組復合物以G5/hDAF表示。

1.2.2 G5/hDAF中DNA對限制性內切酶的抗性分析 取G5/hDAF（氮磷比 10∶1）和 hDAF cDNA 各 1 μg，分別以 XbaⅠ/ClaⅠ雙酶切，2 h后煮沸停止反應，加入十二烷基硫酸鈉（SDS，終濃度為0.4 mol/L）。另取1 μg G5/hDAF復合物（氮磷比10∶1），先加 SDS溶解（終濃度為0.4 mol/L），然后用限制性內切酶XbaⅠ/ClaⅠ消化。將消化物在0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.3 豬精子細胞對外源性DNA的攝取 檢測豬精液密度與活力后，室溫下離心（3 500 r/min，10 min，下同），棄上清。加入SFM/BSA液洗滌精液2次后，SFM液洗滌1次，調整精子細胞密度為107/mL。取100 μL精子細胞懸液置于離心管中，分別加入上述各組G5/hDAF，17℃孵育2 h，對照組只加入相應劑量的hDAFcDNA。每管設3個重復。PBS清洗3次后，保留約100 μL液體，吹打混勻。加入DNaseⅠ至終濃度為100 mg/L，37℃下作用30 min。PBS洗滌3次。保留約100 μL液體。

1.2.4 原位雜交檢測hDAFcDNA對豬精子細胞的轉染效率 按照DNA探針/原位雜交檢測試劑盒說明書操作。高倍鏡下讀片，每片隨機抽取5個視野，計數400個精子細胞，記錄染色陽性細胞數，計算轉染率（轉染率=染色陽性精子細胞數/400×100%）。在原位雜交流程中設定陰性對照，陽性對照為人精子細胞。

2 結果

2.1 G5/hDAF的抗酶切反應 酶切后的G5/hDAF在電泳孔中不遷移，而經SDS處理后可以遷移。復合物中的DNA分子不被限制性內切酶降解，見圖1。

圖1 PAMAM-D/DNA復合物的酶切電泳

2.2 hDAF cDNA對豬精子細胞的轉染效率 在豬精子細胞頭部，特別是頂體后區可見黑色顆粒狀物，見圖2。兩因素析因設計定量資料的方差分析結果表明，不同劑量DNA、不同氮磷比之間轉染率差別有統計學意義（均P<0.01），且兩者之間的交互作用差異有統計學意義（P<0.01），0.4 μg DNA含量、氮磷比20∶1時，細胞轉染率最高，見表1。

圖2 豬精子細胞原位雜交檢測hDAF（BCIP/NBT染色×100）

表1 不同DNA量、不同氮磷比情況下精子細胞轉染效率 （n＝3，%，±s）

表1 不同DNA量、不同氮磷比情況下精子細胞轉染效率 （n＝3，%，±s）

F 組間=16 987.70，F 組內=6 367.42，F 交互=404.10，均 P＜0.01

DNA量（μg）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0氮磷比0 10.4±0.2 28.5±0.2 29.6±0.2 20.3±0.3 22.0±1.0 10∶1 15.2±0.2 40.3±0.1 40.2±0.2 26.4±0.1 22.3±0.1 20∶1 16.3±0.2 47.5±0.2 44.3±0.2 35.5±0.3 24.5±0.1 40∶1 17.4±0.2 46.5±0.5 45.5±0.3 38.6±0.2 29.5±0.2

3 討論

精子載體法制備轉基因動物的關鍵步驟是精子細胞高效穩定地攝取外源基因，進而通過受精過程使外源基因成為胚胎細胞染色體的組成部分，從而培育出轉基因動物。成熟的動物精子在結構與功能上具有結合外源DNA并使其核內化的能力，但外源基因與精子的結合是隨機發生的，穩定性較差。為此，出現了多種試圖促進外源DNA與精子結合的技術，包括電穿孔法、病毒介導和脂質體法等[5]。這些改進方法因存在種種缺點，如對精子產生毒害作用、受精率下降及應用的局限性等，而使精子載體法存在的問題仍然難以得到根本改觀。

PAMAM-D是一種人工合成的新型納米材料，具有成輻射狀對稱的剛性球體結構。與普通高分子聚合物不同，它具有低黏度、高溶解性、可混合性以及高反應性等特點，已成為基因轉移的一個新載體，較傳統載體有明顯優勢。PAMAM-D在基因治療方面的研究很多，且取得了較好的效果[6]。但采用以PAMAM-D介導的精子載體法只見于培育魚類轉基因動物的研究[7]。筆者將之應用于哺乳動物的轉基因操作上是一種新的嘗試。

本研究表明，PAMAM-D分子能阻止PAMAMD/DNA復合物中DNA的電泳遷移，而陰離子去污劑SDS可以通過解離PAMAM-D/DNA復合物使得DNA分子釋放出來，證明PAMAM-D與DNA之間是通過靜電相互作用發生復合的。同時，存在于復合物中的DNA分子不受限制性內切酶的降解，因此推測，這些復合物在活體內或細胞內可能對各種酶類降解有一定的抵抗作用，能夠維持外源性DNA的長期存在，有助于外源基因與精子細胞穩定結合，從而保持轉基因效率的穩定性。本研究發現導入外源質粒的數量直接影響轉染的效率。在0.2 μg組，由于DNA劑量較少使得轉染入精子中的外源基因比例低，在0.8 μg和1.0 μg組精子中的hDAF比0.4 μg和0.6 μg組均低，可能是較高劑量的外源DNA會抑制精子運動，并引發核酸內切酶活性使之降解。本實驗確定hDAF基因對豬精子轉染的最佳用量是 4～6 μg/107，氮磷比20∶1。

PAMAM-D沒有免疫原性，不引起機體免疫反應，無遺傳毒性與細胞毒性，不會導致細胞的轉化與死亡。聯合應用PAMAM-D可望增強SMGT的實用性，為下一步生產異種移植用轉基因豬提供一種新的轉基因方法。

[1]Ghanekar A,Lajoie G,Luo Y,et al.Improvement in rejection of human decay accelerating factor transgenic pig-to-primate renal xenografts with administration of rabbit antithymocyte serum[J].Transplantation，2002,74(1):28-35.

[2]Lavitrano M,Bacci ML,Forni M,et al.Efficient production by sperm--mediated gene transfer of human decay accelerating factor(hDAF)transgenic pigs for xenotransplantation[J].PNAS,2002,99(22):14230-14235.

[3]Teixeira LA,Fricke CH,Bonorino CB,et al.An efficient genetransfer system for hematopoietic cell line using transient and stable vectors[J].J Biotechnology,2001,88(2):159-165.

[4]劉秉乾，馬志方，李勝芝，等.異種移植轉基因用含雜合增強子UI的人衰變加速因子重組基因的構建[J].天津醫科大學學報，2005，11(4)：528-530.

[5]楊惠祥，徐勇，王廣有，等.精子介導轉基因技術的進展與爭論[J].醫學與哲學(臨床決策論壇版)，2006，27(10)：62-64.

[6]Teixeira LA,Fricke CH,Bonorino CB,et al.An efficient genetransfer system for hematopoietic cell line using transient and stable vectors[J].J Biotechnol,2001,88(2):159-165.

[7]楊凱,程漢華,郭一清,等.采用高分子介導精子作載體制備轉基因泥鰍[J].遺傳學報,2001,28(12)：1137-1141.