TNF-α基因多態性與2型糖尿病患者輕度認知功能障礙的相關性

沈芳芳 謝 云 趙 霞 孟憲海 汪瑋琳 韓麗萍 齊秀英

隨著對糖尿病研究的逐步深入，很多學者認為糖尿病與認知障礙之間有明顯的相關性，它是誘發Alzheimer?。ˋlzheimer’s disease，AD）的一個危險因素[1]。因此，對糖尿病患者認知功能障礙的易感因素，尤其遺傳易感性研究對篩選出AD的高危人群及預防和延遲T2DM患者認知減退具有重要意義。為探討TNF-α基因多態性與T2DM合并輕度認知功能障礙（MCI）的關系，本研究分析TNF-α2等位基因在T2DM合并MCI發病中的作用，及T2DM合并MCI的相關危險因素。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2008年5月—2009年1月在天津醫科大學代謝病醫院住院的198例2型糖尿病患者作為調查疾病史；癲；影響認知功能測試的其他嚴重軀體疾病。

1.2 方法

1.2.1 采集資料 分別采集研究對象的性別、年齡、家族史、病程、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（P2BG）、糖化血紅蛋白（HBA1c）、糖尿病并發癥以及是否使用胰島素治療等項目，并計算體質量指數（BMI）。

1.2.2 檢測TNF-α-308A/G基因多態性 應用PCR-RFLP法進行檢測。（1）模板DNA提取:抽取空腹肘正中靜脈血2～3 mL，EDTA抗凝，利用血液基因組DNA抽提試劑盒（大連TaKaRa公司）提取外周血白細胞DNA。（2）PCR擴增：上游引物為 5′－AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT－3′，下游引物為 5′－TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG－3′。PCR 條件為 94℃5 min預變性，35個循環（94℃1 min變性，59℃45 s退火，72℃6O s延伸），72℃5 min終末延伸；擴增產物為107 bp。（3）PCR產物以限制性核酸內切酶NcoⅠ在37℃酶切1 h，2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察基因型結果。（4）序列分析：由天根生化科技（北京）有限公司進行PCR產物的純化和測序。

1.3 統計學方法 所有分析應用SPSS 11.5統計軟件包完成。計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗。計數資料用率或構成比表示，組間的比較采用χ2檢驗。等位基因頻率、基因型頻率的分析采用χ2檢驗。T2DM合并MCI危險因素的分析采用非條件Logistic回歸分析。對象。2型糖尿病的診斷根據1999年WHO診斷標準，運用簡易智能精神狀態檢查量表（MMSE）、畫鐘測驗（CDT），對每位受檢者的認知功能進行綜合評定：MMSE包括定向力、記憶力、注意力和計算力、回憶能力、語言能力5個方面的檢查，滿分為30分；CDT采用國際上普遍采用4分法計分。依據《2006年中國防治認知功能障礙專家共識》：23分＜MMSE＜27分，CDT 0～2分的調查者診斷為MCI。調查對象中的40例MCI患者作為T2DM MCI組，從認知功能正常組中隨機抽取80例患者作為T2DM非MCI組。排除標準：嚴重低血糖以及糖尿病酮癥酸中毒等昏迷史；退行性神經系統疾病，如帕金森病、Down綜合征等；在3個月內有急性腦血管

2 結果

2.1 MCI組和非MCI組臨床及生化指標比較 2型糖尿病患者MCI組與非MCI組的年齡、病程、DM家族史、BMI、P2BG、HbA1c、DM 視網膜病變、DM 周圍神經病變、高血壓比較差別有統計學意義（P＜0.05或 P＜0.01），性別、FBG、總膽固醇、DM 腎病、冠心病以及胰島素治療的差別無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 TNF-α-308A/G基因多態性分析 TNF-α基因在-308位點為G時定義為TNF-α1，為A時定義為TNF-α2。TNF-α PCR產物經限制性核酸內切酶NcoⅠ酶切后，TNF-α-308AA基因型電泳可見：107 bp 1條帶；TNF-α-308 GG基因型電泳可見：87 bp和20 bp 2條帶；TNF-α-308 GA基因型電泳可見：107 bp、87 bp和 20 bp 3條帶，見圖1。2組 TNF-α-308A/G基因型及等位基因的分布差別有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

表1 2型糖尿病患者MCI組和非MCI組臨床及生化指標比較 （±s或構成比）

表1 2型糖尿病患者MCI組和非MCI組臨床及生化指標比較 （±s或構成比）

*P＜0.05，**P＜0.01；表2 同

組別MCI組非MCI組t或 χ2 n 40 80性別（男/女）15/25 36/44 0.61年齡（歲）68.70±7.21 61.09±6.70 5.72**病程（a）14.03±8.54 8.79±6.05 3.87**DM家族史（例）13 47 7.35**組別MCI組非MCI組t或 χ2 n 40 80 BMI（kg/m2）25.09±2.86 26.28±3.27 1.96*FBG(mmol/L)10.42±1.79 10.57±3.47 0.30 P2BG(mmol/L)15.33±2.19 13.47±3.72 3.31**HbA1c 0.095±0.022 0.085±0.022 2.41*組別 n MCI組非MCI組t或 χ2 40 80總膽固醇（mmol/L）5.81±1.35 5.34±1.38 1.78 DM腎病例（%）18（45）36（45）0.00 DM視網膜病變 例（%）26（65）32（40）6.67*DM周圍神經病變 例（%）31（76）41（51）7.66**組別MCI組非MCI組t或 χ2 n 40 80高血壓例（%）31（76）42（52）7.00**冠心病例（%）24（60）59（74）2.36胰島素治療例（%）27（68）64（80）2.27

圖1 TNF-α基因PCR產物限制性酶切電泳圖

表2 TNF-α-308A/G基因多態性分布

2.3 非條件Logistic回歸分析 將MCI組和非MCI組臨床及生化指標中差別有統計意義的9項指標和TNF-α基因型作為自變量，以T2DM是否合并MCI作為因變量，進行非條件Logistic回歸。結果表明，TNF-α、糖尿病周圍神經病變、視網膜病變、年齡、餐后2 h血糖是T2DM合并MCI的危險因素，見表3。

表3 非條件Logistic回歸分析

3 討論

目前醫學界公認的MCI指介于正常老化和癡呆之間的一種認知缺損狀態，主要表現在記憶減退與年齡的不相稱，但沒有達到AD的標準。Logroscino等[2]通過大人群前瞻性研究發現，老年T2DM患者基線認知功能測試的得分低于非糖尿病者，并且在2～6年的隨訪過程中其認知功能下降的危險性增加。

糖尿病患者慢性高血糖及其慢性代謝異?？稍斐赡X血管損害和神經元變性。有研究表明，高血壓、糖尿病、高膽固醇和腦白質變性及腦梗死與MCI有關，提示血管危險因素可能是MCI的重要原因[3]。Akisaki等[4]研究發現，T2DM患者的認知功能障礙主要與糖尿病微血管并發癥有關，與本文調查結果相似。本研究顯示MCI與糖尿病視網膜病變和周圍神經病變有關，后者均為糖尿病常見的微血管并發癥；未見糖尿病腎病在2組之間有差別，可能與例數較少有關。國外研究表明，高血糖時醛糖還原酶活性顯著增高，使葡萄糖轉化為山梨醇增加，可引起神經細胞高滲和水腫[5]。此外，高血糖時tau蛋白和 β 淀粉樣蛋白（amyloid β protein，Aβ）發生非酶糖基化，形成糖基化終末產物（AGEs），后者通過受體途徑刺激免疫應答反應或直接作用產生氧化損傷，導致神經細胞功能障礙甚至死亡。

人TNF-α基因啟動子區域-308位點存在G/A多態性并與TNF-α的表達水平有關。與TNF-α1等位基因比較，TNF-α2基因使TNF-α表達增加，TNF-α的濃度也增加[6]。在AD及MCI患者的大腦、腦脊液及外周血中發現TNF-α的升高。Culpan等[7]發現AD患者TNF-α2等位基因頻率異常增高，而且攜帶TNF-α2等位基因者發病年齡較早。目前大多學者認為TNF-α基因多態性增加了AD的發病風險[8]。Bermejo等[9]研究表明AD腦內炎癥反應增強，活化的炎性細胞和大量炎性細胞因子（主要包括IL和TNF）通過一系列信號傳導通路促使Aβ沉積以及老年斑和神經纖維纏結的形成，造成神經元的損傷和死亡。

本研究結果顯示，TNF-α與DM合并MCI的遺傳易感性相關，推斷TNF-α2等位基因是DM罹患MCI的危險因素。但DM合并MCI的發生為多因素參與，且TNF-α基因多態性在不同人種、地區的差異及與其發病機制目前尚未完全清楚。本研究例數有限，需進一步深入研究。同時，強調早期、有效地治療DM患者的血糖、并發癥等可能是防止MCI發生的有效措施，對預防癡呆可能起到一定的作用。

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