發酵條件對產2，3-丁二醇Klebsiella pneumoniae代謝的影響*

孫麗慧，戴建英，王旭東，修志龍

(大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧大連，116024)

發酵條件對產2，3-丁二醇Klebsiella pneumoniae代謝的影響*

孫麗慧，戴建英，王旭東，修志龍

(大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧大連，116024)

通過批式發酵實驗考察了通氣量和pH對產2，3-丁二醇的Klebsiella pneumoniae CICC 10011代謝特性的影響，確定了發酵2，3-丁二醇的最適條件為:通氣量0.10 vvm，pH值5.8。在該條件下發酵8 h，目標產物濃度達到15.76 g/L，產物得率為0.32 g/g葡萄糖，生產強度為1.97 g/(L·h)。對發酵過程中細胞生長和主要代謝產物的形成進行分析，結果表明，早期乙酸的形成有利于目標產物2，3-丁二醇的積累，后期有機酸用作底物維持細胞生存。調節底物濃度、通氣量和pH，使細胞盡早產生足夠的乙酸，維持較長的對數生長期是發酵生產2，3-丁二醇的關鍵。

2，3-丁二醇，發酵，代謝特性

2，3-丁二醇(2，3-butanediol，2，3-BD)是一種非常重要的化工原料和液體燃料，被廣泛應用于化工、食品、醫藥、燃料以及航空航天等多個領域［1－3］。2，3-丁二醇的生產方法有化學法和生物轉化法。由于其結構的特殊性，采用化學法合成比較困難，成本較高，因而很難實現大規模的工業化生產。生物轉化法即以可再生資源為原料，通過微生物代謝將單糖轉化為目標產物［4－5］。相比化學合成法而言，生物轉化法既符合綠色化工的要求，又可避免化學合成的困難，同時可以實現人類社會生產由傳統的以不可再生化石資源為原料的石油煉制向以可再生生物質資源為原料的生物煉制轉型。

以生物轉化法生產2，3-丁二醇至今已有近百年的歷史。Zeng等［6］研究了呼吸商對產氣節桿菌(Aerobacter aerogenes)發酵2，3-丁二醇的影響，結果表明，在發酵過程中控制最佳呼吸商可獲得高達96.0 g/L的2，3-丁二醇。Ma等［7］從土壤中分離篩選出1株克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM，經離子束誘變后具有高產2，3-丁二醇的能力，在5 L發酵罐中發酵38 h可獲得150 g/L的2，3-丁二醇。迄今為止，相關報道多集中在高濃度目標產物的獲得上，而對2，3-丁二醇發酵過程中代謝產物的形成規律鮮見報道。2，3-丁二醇代謝途徑中副產物較多，包括乙醇、乙酸、甲酸和琥珀酸等，如圖1所示。在2，3-丁二醇發酵過程中，pH和通氧量是2個非常重要的因素，它們對菌體生長和產物形成都有顯著影響。本研究以K.pneumoniae CICC 10011為菌種，通過5 L發酵罐中的批式發酵實驗考察pH值和通氣量對發酵過程的影響，確定發酵條件，并在此基礎上分析主要代謝產物的形成規律，以期加深對K.pneumoniae產2，3-丁二醇生理及代謝特性的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種K.pneumoniae CICC 10011，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

種子培養基和發酵培養基見文獻［8］。

主要儀器:pH電極;5 L自控發酵罐(BIOTECH-5BG，上海保興生物設備工程有限公司);721分光光度計;恒溫振蕩培養箱;葡萄糖分析儀(SBA-50B，山東省科學院);氣相色譜儀(GC-14B，日本島津公司);高效液相色譜儀(Waters-600，美國)。

1.2 方法

1.2.1 種子培養

按2%(φ)接種量將K.pneumoniae接種到含有50 mL液體培養基的500 mL三角瓶中，在37℃，搖床轉速190 r/min條件下，培養24 h。

1.2.2 批式發酵實驗

在5 L自控發酵罐中進行。裝液量2 L，接種量5%(φ)，溫度 37℃，攪拌轉速 300 r/min，用 5 mol/L的NaOH溶液調節pH，向發酵罐中通空氣維持微氧條件，考察不同的通氣量和pH值對發酵過程的影響，定期取樣分析菌體濃度、葡萄糖濃度，樣品離心后經氣相色譜和高效液相色譜分析各產物含量，培養10～12 h，葡萄糖消耗盡時結束發酵。

1.2.3 分析方法

圖1 微氧條件下K.pneumoniae代謝葡萄糖產2，3-丁二醇的途徑

葡萄糖采用葡萄糖分析儀測定;菌體濃度以波長650 nm下的光密度(OD值)表示;2，3-丁二醇、乙偶姻和乙醇濃度用氣相色譜法檢測，色譜柱(Φ5 mm×2 m)填料為Chromsorb 101，柱溫190℃，汽化室與檢測器溫度均為200℃，載氣為N2，流速50 mL/min，進樣量1 μL，采用外標法定量;發酵液中有機酸(琥珀酸、甲酸、乙酸)采用高效液相色譜法檢測［9］。

2 結果與討論

2.1 不同通氣量對發酵過程的影響

以濃度約為50 g/L葡萄糖為底物，在37℃、pH值5.5條件下，考察了不同通氣量對發酵過程的影響，實驗結果如圖2和圖3所示。

圖2 不同通氣量對主要產物形成、底物消耗和菌體生長的影響

從圖2可知，通氣量越大，菌體生長越迅速，發酵 8 h，通氣量為0.12 vvm時的OD650nm已經達到8.88，而通氣量越大，副產物乙醇的濃度越低，當通氣量為0.12 vvm，乙醇終濃度僅為4.86 g/L，而通氣量為0.04 vvm時乙醇終濃度可達6.57 g/L。由于菌體內不同產物代謝途徑需氧不盡相同，發酵過程中通氣量過大，溶液中溶氧濃度高會造成葡萄糖的主要代謝物為生物量和CO2，而使糖的轉化效率降低;而通氣量過低，代謝向乙醇、乳酸等需氧更少的途徑偏移［10］。從本實驗結果來看，當通氣量為0.10 vvm時，目標產物的質量濃度和積累速度都是最高的，在發酵第9 h，2，3-丁二醇與乙偶姻濃度之和達16.16 g/L，產物得率為0.32 g/g葡萄糖，生產強度為1.80 g/(L·h)，因此，選擇通氣量為0.10 vvm較合適。

對不同通氣量條件下發酵過程中產生的有機酸進行了分析(圖3)，可以看出，隨著發酵的進行，甲酸和琥珀酸的濃度逐漸增加，而乙酸濃度的變化趨勢是先增加，然后降低。在發酵后期甲酸和琥珀酸含量均有不同程度的下降，主要原因可能是此時培養基中的葡萄糖含量較低，導致部分有機酸被微生物細胞利用以維持自身生長，另有部分有機酸則被微生物代謝分解而造成了發酵后期有機酸含量的下降，而此時生物量及主產物2，3-丁二醇基本不變，乙酸濃度卻有所回升，這可能是其它有機酸代謝轉化為乙酸的結果。從實驗結果可知，通氣量越大，越有利于乙酸和甲酸的形成，當通氣量為0.12 vvm甲酸最高濃度可達0.59 g/L，乙酸最高濃度可達0.32 g/L，而通氣量為0.04 vvm時甲酸最高濃度僅為0.21 g/L，乙酸最高濃度為0.27 g/L。通氣量越小，琥珀酸的濃度越高，當通氣量為0.04 vvm琥珀酸最高濃度可達1.94 g/L，而在通氣量為0.12 vvm時，最高琥珀酸濃度為1.69 g/L。這可能是由于在K.pneumoniae代謝過程中，每形成1 mol琥珀酸，就需要1 mol的 CO2，通氣量越大，發酵體系中可利用的CO2隨著尾氣被排出發酵罐速度越快，使生物合成琥珀酸所必需的CO2量減少，從而不利于琥珀酸的形成。

圖3 通氣量對有機酸形成的影響

2.2 不同pH值對發酵過程的影響

以濃度約為50 g/L葡萄糖為底物，在37℃、通氣量為0.10 vvm條件下，考察了不同pH值對發酵過程的影響，實驗結果如圖4和圖5所示。

圖4 不同pH值對主要產物形成、底物消耗和菌體生長的影響

從圖4可知，在本實驗所考察的范圍內，pH值越高，菌體的濃度越高。從圖4還可以看出，在pH為5.0時，可獲得最高濃度的副產物乙醇，為7.41 g/L，而當pH值為5.8時，乙醇生成量相對較少，最高濃度為5.25 g/L。從底物消耗的情況來看，當pH值為5.8時，葡萄糖消耗速率最快。本實驗中，當pH值為5.8時目標產物的質量濃度和轉化率均高于其他pH值，在發酵第 8 h，2，3-丁二醇與乙偶姻之和為15.76 g/L，產物得率為0.32 g/g葡萄糖，生產強度為1.97 g/(L·h)。隨著發酵的進行，在發酵后期，目標產物濃度有所下降，這可能是由于此時葡萄糖已經被完全耗盡，微生物則利用2，3-丁二醇作為底物，將其代謝分解，而造成了在發酵后期產物濃度的下降。Stormer等［11－12］在研究中發現，在 pH 值為 5.8 時，合成2，3-丁二醇的第1個關鍵酶乙酰乳酸合成酶的活性最高，且另外2種關鍵酶(乙酰乳酸脫羧酶和乙偶姻還原酶)在pH值5.8時也能保持相對較高的活性，因此，結合本研究結果，選擇pH值為5.8較合適。

對不同pH值條件下發酵過程中產生的有機酸進行了分析(圖5)，從實驗結果可知，pH值越大，越有利于琥珀酸的形成，當pH值為6.0、發酵9 h時，琥珀酸達到了其最高濃度，為1.99 g/L，在發酵后期琥珀酸的濃度也有所降低。當pH值為5.8時，甲酸可以獲得的最高濃度為0.91 g/L，而在pH值5.0時，甲酸在發酵過程中的濃度始終保持較低的水平。乙酸在pH值為6.0可獲得最高濃度為0.45 g/L，而在pH為5.0最高濃度為0.28 g/L。

圖5 不同pH值對有機酸形成的影響

圖6 批式發酵中細胞生長和代謝流量的變化情況

2.3 K.pneumoniae CICC 10011 發酵制備 2，3-丁二醇過程中產物的變化規律

在上述實驗中發現，在不同的通氣量或pH條件下的發酵，底物消耗、菌體生長以及各產物的變化都有著類似的規律，在通氣量0.10 vvm、pH5.8條件下，最有利于2，3-丁二醇的發酵，因而以此為例，分析發酵過程中細胞生長和各產物形成情況，如圖6所示。

將K.pneumoniae CICC 10011代謝葡萄糖的間歇發酵分為4個階段，第1階段從0～2 h，這個階段為發酵的初始階段，菌體處于延滯期，OD值增加緩慢，葡萄糖消耗也較慢，但副產物乙酸在此階段迅速積累并qAcetate達到最高值為3.98 mmol/(g·h)，除乙酸外，其他產物積累量很少。第2階段從2～6 h，這段時期進入細胞對數生長期，菌體生長迅速，葡萄糖的消耗速率明顯增加，除乙酸外的其它產物也迅速積累，qGlucose、q2，3-BD、qEthanol、qSuccinate和 qFormate所達到的最大值分別為 19.61 mmol/(g·h)、9.12 mmol/(g·h)、7.76 mmol/(g·h)、1.97 mmol/(g·h)和 1.22 mmol/(g·h)。值得注意的是，乙酸的比生成速率在這個階段出現了負值，也就意味著前期所形成的乙酸在此階段作為底物轉化成了其它物質。第3階段為6～8 h，在這段時期，菌體濃度增加變緩，q2，3-BD和qEthanol也隨之下降，而qAcetate卻逐漸增加。第4階段為8～9 h發酵末期，此階段葡萄糖已經基本消耗完全，因此有機酸被作為碳源而利用，有著不同程度的濃度降低現象。由于底物耗盡，細胞停止生長，菌體濃度開始下降，產物合成也基本停止。

從圖6可以明顯看出，乙酸的形成要早于其它有機酸的合成，也早于目標產物2，3-丁二醇和乙偶姻的合成。Zheng等［13］在利用 K.pneumoniae CGMCC 1.636 6代謝甘油生產1，3-丙二醇的研究中也類似的發現，在所有代謝產物中，乙酸是最早形成的。從克雷伯氏菌代謝葡萄糖的途徑(圖1)可以看出，乙酸的產生伴隨有ATP生成，這將為后續的發酵過程提供更多的能量;另一方面，乙酸的早期合成也十分有利于目標產物2，3-丁二醇的合成。據文獻報道，乙酸能夠激活 2，3-丁二醇合成途徑中的 3種關鍵酶［11－12］，因此有學者在發酵 2，3-丁二醇的研究中添加乙酸以期提高2，3-丁二醇的濃度和轉化率。Yu和Saddler［14］在研究中發現，在 K.pneumoniae 發酵 2，3-丁二醇初期添加適量的乙酸有利于2，3-丁二醇的積累和底物的充分利用，當添加乙酸量為0.5%(φ)時是最合適的，與未添加乙酸的對照組相比，2，3-丁二醇產量提高了近3倍，同時菌體濃度也有明顯提高，所添加的乙酸在發酵過程中被利用，但當添加的乙酸量超過2%(φ)時就可完全抑制細胞生長。Nakashimada 等［15］在 Paenibacillus polymyxa 發酵 2，3-丁二醇的研究中也發現，添加適量的乙酸，可以提高產物2，3-丁二醇的產量和葡萄糖轉化率，且乙酸與葡萄糖消耗的摩爾比為0.35 mol/mol。

比較不同通氣條件下第一階段乙酸的比生成速率可知，O2對乙酸的比生成速率有明顯影響。在pH值5.5、0.08 vvm時，乙酸的比生成速率最大，達到4 mmol/(g·h)。而通氣量為0.1vvm、pH值5.8～6.0時乙酸的比生成速率最大亦為4 mmol/(g·h)，此時2，3-丁二醇的比生成速率亦相應達到最大值。從這些數據可推斷出，此菌株發酵生產2，3-丁二醇時乙酸的比生成速率臨界值為4 mmol/(g·h)。

綜合通氣量和pH對2，3-丁二醇發酵的影響可看出，合理的2，3-丁二醇發酵控制策略應該是同時控制通氣量和pH值，而不是采取恒定的發酵條件。在發酵前期，采用高通氣量和高pH值，有利于菌體生長和乙酸生成。一旦乙酸的濃度累積到足以誘導2，3-丁二醇代謝途徑關鍵酶，則應降低通氣量和pH使菌體內糖代謝向2，3-丁二醇途徑偏移，從而提高2，3-丁二醇的產量。Ji等［16］利用 K.oxytoca 代謝葡萄糖產2，3-丁二醇，采用2段攪拌方式改變溶液中溶氧，使發酵液中2，3-丁二醇濃度、轉化率和生產強度分別提高了6.23%，6.22%和22.14%。由此可見，依據菌種的代謝特性采取適當的控制策略，就可以提高2，3-丁二醇的產量。

3 結論

(1)對K.pneumoniae CICC 10011批式發酵制備2，3-丁二醇的條件進行了研究，確定了發酵2，3-丁二醇的最適通氣量為0.10 vvm，最適pH值為5.8。

(2)對發酵過程中細胞生長和主要代謝產物的形成進行了分析，發現在細胞生長延滯期快速積累乙酸，而在細胞對數生長期大量積累2，3-丁二醇、有機酸，并消耗乙酸;當細胞生長進入靜止期后，產生的2，3-丁二醇減少，消耗有機酸的同時增加了乙酸的形成。

(3)根據K.pneumoniae的代謝途徑并結合以往報道分析表明，早期乙酸的形成有利于目標產物2，3-丁二醇的積累。調節底物濃度、通氣量和pH值，使細胞盡早產生足夠的乙酸，維持較長的對數生長期是發酵生產2，3-丁二醇的關鍵。

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Effects of Fermentation Conditions on Metabolism of Klebsiella pneumoniae Producing 2，3-Butanediol

Sun Li-hui，Dai Jian-ying，Wang Xu-dong，Xiu Zhi-long
(School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China)

The batch fermentation for 2，3-butanediol production by Klebsiella pneumoniae CICC 10011 was investigated.The results showed that the optimum conditions for fermentation were 0.10 vvm of air flow，5.8 of pH value.The concentration of target products(2，3-butanediol and acetoin)was 15.76 g/L with a productivity of 1.97 g/(L·h)after 8 hours’batch fermentation under the optimized conditions，corresponding to 32%of yield from glucose.The glucose batch fermentation by Klebsiella pneumoniae CICC 10011 exhibited the sequential synthesis of main products，and acetate formation was earlier than other products formation.Based on the analysis of cell growth and formation of main products，the early formation of acetate is favorable for 2，3-butanediol production.Therefore，it is important to produce adequate acetate as early as possible and maintain long logarithmic growth phase by means of adjusting substrate concentration，air flow and pH.

2，3-butanediol，fermentation，metabolic characteristic

博士，講師(修志龍教授為通訊作者)。

*國家高技術發展計劃項目(863計劃)(No.2009AA05Z443)資助

2010－04－06，改回日期:2010－05－21