氧化葡萄糖酸桿菌立體選擇催化2-甲基-1，3-丙二醇合成(R)-β-羥基異丁酸*

氧化葡萄糖酸桿菌立體選擇催化2-甲基-1，3-丙二醇合成(R)-β-羥基異丁酸*

魏國棟，魏東芝，林金萍
(華東理工大學，魯華生物技術研究所，生物反應器國家重點實驗室，上海，200237)

β-羥基異丁酸是一種重要的化工醫藥產品，主要用于合成降壓藥卡托普利和其它的光學活性物質。試驗利用氧化葡萄糖酸桿菌不對稱氧化2-甲基-1，3-丙二醇合成了光學純的(R)-β-羥基異丁酸，研究表明:在28℃和pH值5.5、底物濃度5 g/L、濕細胞濃度20 g/L的情況下，經過10 h的反應，(R)-β-羥基異丁酸的濃度達到20.5 g/L，轉化率和光學純度分別達到88.6%和95.3%。在培養基中添加一定量(0.1%)的1，2-丙二醇和乙二醇對菌體生長、立體選擇性和催化活性都有一定的促進作用。通過流加2-甲基-1，3-丙二醇使其在反應體系中的濃度維持在5 g/L以下，以消除過高的底物濃度對細胞活性的抑制，在3.7 L反應器中經過24 h的反應，(R)-β-羥基異丁酸的濃度提高到50.2 g/L，摩爾轉化率和光學純度分別達到90.5%和93.2%。

氧化葡萄糖酸桿菌，生物轉化，2-甲基-1，3-丙二醇，(R)-β-羥基異丁酸

氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)是一種專性好氧的革蘭氏陰性菌，屬于醋酸桿菌科，以能夠不完全氧化很多糖醇類化合物而著稱，而其大多數參與反應的酶位于細胞膜上，催化反應生成的相應產物(醛、酮以及有機酸等)幾乎能夠全部分泌到培養基中，催化反應過程無需通過透膜運輸，大大提高了其應用價值，相關研究和應用越來越受到研究人員的重視［1－6］。

光學活性β-羥基異丁酸，是具有不對稱碳原子的雙功能性物質，作為有機合成的基礎材料，廣泛用于合成多種生理活性物質，其合成方法一直是人們研究的熱點。單一構型的R型β-羥基異丁酸可以作為有機合成的手性砌塊參與其它重要手性分子的合成。目前，R型β-羥基酸的制備一般采用化學拆分的方法，存在副產物如S型β-羥基酸多，后續分離困難的缺陷，不能滿足有關領域的需要，而生物轉化法具有良好的區域選擇性和立體選擇性。目前已有利用Gluconobacter roseus IAM 1841，Acetobacter sp.和Acetobacter pasteurianus DSM 8937不對稱氧化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的研究，但是β-羥基異丁酸的得率都比較低。目前，利用微生物氧化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的研究中，最高的產物濃度也只有 29 g/L［7－10］，因此有必要進一步提高轉化產物的濃度。本文主要以氧化葡萄糖酸桿菌靜息細胞為生物催化劑，利用其立體選擇性和區域選擇性的不完全氧化功能，催化2-甲基-1，3-丙二醇生成光學純(R)-β-羥基異丁酸，確定了轉化產物的組成，并對全細胞催化過程進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

氧化葡萄糖桿菌DSM 2003(Gluconobacter oxydans DSM 2003)，由華東理工大學生物反應器國家重點實驗室保藏。

1.2 儀器與試劑

恒溫搖床，上海欣鑫自動化設備有限公司;3.7 L發酵罐，瑞士比歐生物工程公司;高效液相色譜，美國安捷倫1100 series。

2-甲基-1，3-丙二醇和β-羥基異丁酸甲酯購自西格瑪奧德里奇公司，其余試劑為市售分析純。

1.3 菌體培養

1.3.1 菌體搖瓶培養

發酵培養基配方:山梨醇73.0 g/L，酵母粉18.4 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，KH2PO41.52 g/L，MgSO4·7H2O 0.47 g/L。接種后置于搖床內在28℃，250 r/min下恒溫振蕩培養。

1.3.2 菌體發酵罐培養

在3.7L發酵罐中配制2 L培養基。發酵期間主要控制參數如下:(1)溶氧。通氣量控制在300 L/h，發酵罐罐壓控制在0.3～0.6×105Pa，最低攪拌轉速控制在400 r/min，當發酵罐溶氧降至30%以下時，提高轉速以增加溶氧，最高轉速為1 000 r/min。(2)pH值。自動流加2 mol/L的NaOH溶液，保持pH值在6.0左右。(3)溫度。培養過程中溫度保持在28℃。

1.4 2-甲基-1，3-丙二醇轉化反應

1.4.1 搖瓶轉化

用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配成一定菌體濃度的菌懸液，加入一定量的底物2-甲基-1，3-丙二醇，反應體系為10 mL，置于50 mL的三角燒瓶中，于28℃、250 r/min下反應。搖瓶轉化實驗均做3個平行樣，取實驗數據平均值。

1.4.2 3.7 L發酵罐轉化

通過調節轉速、罐壓和通氣速率來控制溶氧在30%以上。間隔0.5～1 h取樣用氣相色譜分析底物濃度，隨時調整底物流加速度，使反應器內的底物濃度控制在5 g/L左右。

1.5 產物的分離純化

轉化液經離心除去菌體，真空旋轉蒸發濃縮。經半制備色譜分離純化得到目標產物。

1.6 分析方法

1.6.1 2-甲基-1，3-丙二醇測定方法的確定

具體色譜條件為:氣相色譜(Agilent 6890)，DBWAX毛細管柱，進樣口溫度為250℃，檢測器的溫度為280℃。升溫程序為:100℃保持2 min，然后以20℃/min升溫至180℃，保持1 min，再以30℃/min升溫至220℃，保持5 min。

1.6.2 β-羥基異丁酸測定方法的確定

液相色譜條件:高效液相色譜(Agilent 1100 series)，ZORBAX SB-Aq 柱，柱溫30℃，進樣 5 μL，流動相為0.1%的稀磷酸溶液，流速1 mL/min，紫外210 nm波長下檢測。進樣前，樣品經過0.22 μm濾膜過濾。

1.6.3 β-羥基異丁酸對映體過量值測定條件的確定

(R，S)-β-羥基異丁酸甲酯標品用HP-chiral 20B手性柱在Agilent 6890氣相色譜儀上進行分析。樣品預處理:1 mL轉化液加入2 mL甲醇(含3%H2SO4)，在密閉的條件下于80℃反應3 h，生成甲酯后加入2 mL CHCl3萃取，然后用氣相色譜進行分析。

色譜條件:氣相色譜(Agilent 6890)，HP-chiral 20B毛細管柱，進樣口溫度為120℃，檢測器的溫度為180℃，流速為0.7 mL。升溫程序為:80℃保持0.2 min，然后以2.5℃/min升溫至85℃，保持0.5 min。然后以1.5℃/min升溫至95℃，保持0.5 min。再以1℃/min升溫至105℃，保持10 min。

2 結果與討論

2.1 氧化葡萄糖酸桿菌靜息細胞催化2-甲基-1，3-丙二醇的產物生成情況分析

將氧化葡萄糖酸桿菌靜息細胞催化2-甲基-1，3-丙二醇的轉化液進行HPLC分析，出現3個產物峰(圖1)。為了弄清反應過程，優化反應條件，有必要對這3個產物進行鑒定。

圖1 G.oxydans不對稱氧化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸

首先對反應產物進行分離純化。反應液經離心除去菌體，低溫下真空旋轉蒸發濃縮。用半制備色譜(Waters)進行分離純化，色譜柱為Atlantis prep dC18OBD(Waters，5 μm，Φ19 mm ×100 mm)，流動相為0.1%的磷酸溶液，流速為10 mL/min，上樣量為1 mL，分別收集3個組分。將3個組分分別于低溫下真空旋轉蒸發濃縮，然后用半制備色譜分別進行2次純化，流動相為5%的甲醇溶液。

產物的鑒定。先將2次純化之后收集到的組分直接用GC-MS檢測，第1組分和第3組分未能檢測到結果，而第2組分經檢測為2-甲基丙烯醛，結果如圖2。

圖2 第2組分的氣質聯用圖譜

通過對2-甲基-1，3-丙二醇轉化過程推斷分析，第1和第3組分很有可能是有機酸，所以先對產物進行衍生化，然后用氣質聯用進行分析。根據圖3和圖4可知，第1組分是目標產物β-羥基異丁酸，第3組分是2-甲基丙烯酸。2個副產物2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸可能的形成途徑是:底物2-甲基-1，3-丙二醇在氧化葡萄糖酸桿菌乙醇脫氫酶的作用下首先生成中間產物β-羥基異丁醛，而β-羥基異丁醛在氧化葡萄糖酸桿菌細胞其它酶的作用下發生脫水反應而形成2-甲基丙烯醛，繼續氧化后生成2-甲基丙烯酸。副產物形成的確切途徑有待于進一步研究。

圖3 第1組分衍生物的氣質聯用圖譜

圖4 第3組分衍生物的氣質聯用圖譜

2.2 靜息細胞轉化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的反應過程

2.2.1 底物濃度對產物生成和選擇性的影響

由圖5可知，氧化葡萄糖酸桿菌轉化2-甲基-1，3-丙二醇的效率和選擇性對底物濃度有依賴性。在底物濃度較低時，隨著初始底物濃度的增加，反應效率也隨之升高，在底物濃度為30 g/L時產物濃度達到最高。隨著底物濃度的進一步提高，由于底物對細胞的活性產生明顯地抑制，催化效率開始出現下降。產物的對映體選擇性(e.e.)隨著底物濃度的增加而降低。綜合轉化效率和產物光學純度考慮，確定反應體系中的底物濃度為5 g/L。

2.2.2 細胞濃度對反應的影響

反應體系中的菌體量會直接影響參與反應的酶量，進而影響其轉化的反應速度以及最終的轉化效果。由圖6可知，細胞濃度對產物的光學純度沒有太大影響。轉化效率隨著細胞濃度的增加而逐漸提高。當細胞濃度超過20 g/L時，隨著細胞濃度的進一步提高，轉化效率基本不再變化。因此，從高效利用菌體的角度出發，確定氧化葡萄糖酸桿菌全細胞轉化體系中的細胞濃度為20 g/L。

圖5 底物濃度對轉化效率和選擇性的影響

圖6 細胞濃度對轉化效率和選擇性的影響

2.2.3 pH值對2-甲基-1，3-丙二醇轉化反應的影響

由于酶的構型與其離子化狀態有關，因此通過改變pH值可以改變酶反應的選擇性。由圖7可知，反應體系的pH值為5.5時，轉化效率和產物的光學純度達到最高，由此確定反應的最適pH值為5.5。

圖7 pH對轉化效率和選擇性的影響

2.2.4 溫度對2-甲基-1，3-丙二醇轉化的影響

不同的溫度下，菌體酶的活性不同，反應速率會有所變化，立體選擇性也會有所不同。在合適的溫度下，酶系能表現最大的活性。由圖8中可知，當溫度小于28℃時，隨著溫度的升高，活化分子增加，酶催化活性提高，轉化速率也在提高;而當溫度大于28℃時，隨著溫度升高轉化速率開始下降，且產物光學純度也略有下降，因此選擇該轉化反應最適溫度為28℃。

圖8 溫度對轉化效率和選擇性的影響

2.2.5 在培養基中添加誘導物對菌體生長和細胞催化活性的影響

為了研究菌體培養階段添加醇類物質對菌體轉化能力的影響，實驗中選取了乙醇、乙二醇、1-丙醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、甘油、1-丁醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇和 2-甲基-1，3-丙二醇等化合物，于接種前添加在培養基中，添加濃度分別為0.1%。培養結束后，收集菌體，然后取相同量菌體進行轉化反應，底物濃度為5 g/L，轉化1 h后，用HPLC測定轉化液中的β-羥基異丁酸濃度。將轉化液衍生化后用GC測定β-羥基異丁酸的光學純度。結果如表1所示，在培養基中添加不同誘導物，對菌體轉化活性產生不同程度的影響，對選擇性的影響不大。在培養基中添加0.1%的1，2-丙二醇和乙二醇，菌體轉化活性均有較大提高，但乙二醇對菌體的生長有一定的抑制作用;在培養基中添加0.1%的2-甲基-1，3-丙二醇、甘油和2，3-丁二醇，菌體轉化活性也有一定幅度提高。

在最優搖瓶轉化條件下，經過10 h的反應，(R)-β-羥基異丁酸的濃度達到20.5 g/L，轉化率和光學純度分別達到88.6%和95.3%。

2.3 在3.7 L生物反應器中轉化2-甲基-1，3-丙二醇

采用上述最適條件，在3.7 L反應器中進行氧化葡萄糖酸桿菌細胞轉化2-甲基-1，3-丙二醇的反應。為了消除底物對細胞活性的抑制，采取流加策略維持反應體系中的底物濃度不超過5 g/L，結果如圖9所示。在反應開始后10 h內，反應非常迅速。隨著反應的進行，產物積累到30 g/L時，產物抑制效應逐漸顯現，反應速率下降。當反應進行到2 4 h時，(R)-β-羥基異丁酸的濃度達到50.2 g/L，轉化率和光學純度分別達到90.5%和93.2%。相比于搖瓶中的轉化結果，發酵罐中的轉化率和積累的(R)-β-羥基異丁酸濃度都有明顯的提高。同時對副產物2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸的濃度進行了測定，發現它們都是很微量的，濃度都小于1 g/L。

表1 添加劑對氧化葡萄糖酸桿菌細胞生長、光學選擇性和催化活性的影響

圖9 在3.7 L發酵罐中補料分批轉化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸

3 結論

在氧化葡萄糖酸桿菌催化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的過程中，有副產物2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸的生成，但濃度都小于1 g/L。在所考察的影響因素(溫度、pH值、初始底物濃度和細胞濃度等)中，底物濃度對產物的合成效率和選擇性的影響最顯著，產物選擇性隨著底物濃度增加而降低，5 g/L的底物就會對細胞活性產生抑制。在菌體培養過程中，添加0.1%的1，2-丙二醇對菌體生長、立體選擇性和催化活性有一定的促進作用。最終，在溫度28℃、pH值5.5、細胞濃度20 g/L、流加底物(≤5 g/L)的情況，3.7L反應器中(R)-β-羥基異丁酸的產量達到50.2 g/L，轉化率和光學純度分別達到90.5%和93.2%。

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Enantioselective Oxidation of 2-methyl-1，3-propanediol to β-hydroxyisobutyric Acid Using Whole Cells of Gluconobacter oxydans DSM 2003

Wei Guo-dong，Wei Dong-zhi，Lin Jin-ping
(State Key Lab of Bioreactor Engineering，New World Institute of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China)

β-Hydroxyisobutyric acid(β-HIBA)is an important chemical commodity，which is used in the synthesis of Captopril and other optically active compounds.Microbial asymmetric oxidation of 2-methyl-1，3-propandiol using resting cells of Gluconobacter oxydans DSM 2003 was investigated for the synthesis of R-enantiomers of β-HIBA.The results indicated that the concentration of R-β-HIBA reached 20.5 g/L with a molar conversion rate of 88.6%and the optical purity of 95.3%at 10 h under the following conditions:temperature 28℃，pH5.5，substrate concentration 5 g/L and cell concentration 20 g/L.Biamass，stereo-selectivity and cell activity of Gluconobacter oxydans DSM 2003 were improved when 0.1%1，2-propanediol or ethylene glycol was added in the culture medium.Under the optimized reaction conditions in 3.7 L bioreactor，the concentration of R-β-HIBA reached 50.2 g/L with a molar conversion rate of 90.5%and the optical purity of 93.2%at 24 h in a 2-l batch reaction.It was proved efficient and a potential process for the oxidation of 2-methyl-1，3-propanediol to(R)-β-HIBA.

Gluconobacter oxydans，bioconversion，2-methyl-1，3-propandiol，β-hydroxyisobutyric acid

博士(林金萍為通訊作者)。

*國家973計劃項目基金(No.2009CB724703)和生物反應器工程國家重點實驗室專項經費(No.2060204)資助

2010－01－19，改回日期:2010－05－25