Alcalase堿性蛋白酶水解厚殼貽貝蛋白*

戴志遠，張婷，張燕平，盧延斌，張艷萍

(浙江工商大學水產品加工研究所，浙江杭州，310012)

Alcalase堿性蛋白酶水解厚殼貽貝蛋白*

戴志遠，張婷，張燕平，盧延斌，張艷萍

(浙江工商大學水產品加工研究所，浙江杭州，310012)

以厚殼貽貝為原料，Alcalase2.4L堿性蛋白酶為酶源，在單因素試驗的基礎上，以還原力A700為指標，運用響應面分析法(RSM)得到Alcalase2.4L酶解厚殼貽貝蛋白的優化條件為:底物濃度［S］3.2%、［E］/［S］2.12%、溫度55.54℃、pH8.66、時間2h，該條件下制備的酶解物的還原能力為0.587。同時證明了該酶解物具有顯著清除DPPH自由基活性和較強的超氧陰離子自由基清除能力。

厚殼貽貝，酶解，抗氧化，響應面分析法

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)，富產于浙江省嵊泗列島周圍海域，是一種高蛋白，低脂肪，富含多種營養成分的海洋軟體動物［1］，具有很高的藥用價值和食療功效。據《本草綱目》記載，貽貝肉能治“虛勞傷憊，精血衰少，吐血久痢，腸鳴腰痛”。隨著養殖技術日趨完善，貽貝年產量日益增高，貽貝加工與高值化利用逐漸引起人們的注意，但目前對其深層的應用研究報道較少。

近年來，隨著對生物活性肽的研究日趨升溫，以天然食品作為蛋白源生產的抗氧化肽因其高效、低毒、易吸收等特點越來越受到重視。而水產品因其高蛋白、來源豐富等特點成為制備抗氧化肽的優良原料。Klompong［2］等研究了水解度和不同酶源對黃色條紋鲹蛋白酶解物抗氧化活性的影響。Je［3］、莊永亮［4］等分別利用海魚副產物、海蜇制得抗氧化肽;趙謀明［5］等則對藍園鲹抗氧化肽的抗氧化穩定性做了研究;胡雪瓊［6］、邱春江［7］等分別測定了馬氏珠母貝肉酶解物和貽貝酶解物對自由基的清除作用。

本研究以厚殼貽貝肉為原料，利用響應面分析法(RSM)優化厚殼貽貝蛋白的酶解工藝，為厚殼貽貝抗氧化酶解物的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

1.1.1 材料

厚殼貽貝:浙江省嵊泗縣華利水產有限公司提供;Alcalase2.4L堿性蛋白酶(9.4×104U/g):諾維信酶制劑公司;DPPH:Sigma公司;其它試劑均為分析純。

1.1.2 設備

PB-10 pH計(德國賽多利斯有限公司);JB-3型定時恒溫磁力攪拌器(上海雷磁新涇儀器有限公司);Labconco 2.5L冷凍干燥機;RC-6 Plus高速冷凍離心機(美國熱電儀器有限公司);Spectrumlab 22pc型分光光度計(上海棱光技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 厚殼貽貝脫脂干粉及其酶解物的制備

新鮮厚殼貽貝洗凈，去殼及毛須，打漿機勻漿至糊狀，凍藏，冷凍干燥得厚殼貽貝粉末。貽貝粉末在40℃下，按1∶4的比例加入95%乙醇脫脂4 h，重復3次。將脫脂后的樣品于40℃真空干燥，粉碎并過100目篩，得脫脂干粉。

按底物濃度，準確稱取脫脂干粉于酶反應器中，加入去離子水攪拌均勻，超聲混合30 min，均質10 min，預熱至酶解溫度，用0.5 mol/L的NaOH溶液調節pH值，加入酶啟動酶解反應，連續攪拌，采用pH-stat法滴加0.2 mol/L的NaOH溶液維持反應體系的pH恒定。反應結束后，95℃水浴滅酶10 min，至室溫，在8 500 r/min下離心15 min，將上清液冷凍干燥。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 成分分析

水分的測定:GB/T 5413.8－1997常壓干燥法(直接干燥法);脂肪的測定:GB/T 5009.6－2003索氏提取法;蛋白質的測定:GB/T5009－2003半微量凱氏定氮法，轉換系數為 6.25;灰分的測定:GB/T 5009.4－2003高溫灰化法測定;多糖的測定:苯酚硫酸法［8］。

1.2.2.2 水解度(DH)的測定

pH-stat法［9］。

式中:B為堿液的體積，mL;Nb為堿液濃度，mol/L;α為α-氨基的解離度;Mp為底物中蛋白質的總量，g;htot為底物中蛋白質的肽鍵總數，mmol/g(蛋白質)。

1.2.2.3 還原力的測定［10－11］

取樣品2 mL(濃度為8 mg/mL)，加入2 mL 0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖液和2 mL 1%的鐵氰化鉀［K3Fe(CN)6］溶液，混勻，50℃水浴保溫 20 min，再加入2 mL 10%的三氯乙酸(TCA)溶液，混勻后離心，取上清液2mL，加入2 mL純水和0.1%的FeCl3，混勻后于50℃水浴保溫10 min，測定700 nm下的吸光值。吸光值越大表示還原力越強。以純水代替樣品作空白。1.2.2.4 DPPH自由基清除能力的測定［12］

將樣品分別用超純水配成濃度為1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL的溶液，分別取2 mL加入1×10－4mol/L的DPPH 80%的乙醇溶液2 mL，混勻，室溫下避光靜置30 min，以2 mL 80%乙醇溶液代替DPPH溶液為空白組，以2 mL的超純水代替樣品溶液為對照組，分別于 517 nm 測定吸光值 Ai、Aj、Ac。

清除DPPH自由基活性的計算公式:

清除率(P)/%=［(1－(Ai－Aj)/Ac］×100

1.2.2.5 超氧陰離子自由基清除率的測定

采用鄰苯三酚自氧化法［13］。將樣品分別用超純水配成濃度為1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 mg/mL 的溶液，取1 mL加入1.8 mL 50 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH值8.2)，混勻，25℃水浴保溫10 min后加入0.1 mL 10 mmol/L鄰苯三酚(用10 mmol/L HCl配制)，迅速混勻倒入比色皿開始計時，每隔30 s在325 nm下測吸光值，持續5 min。以1 mL超純水代替樣品作為對照組。分別作吸光值隨時間變化的回歸方程，得到斜率即鄰苯三酚自氧化速率V樣品、V對照。

2 結果與討論

2.1 厚殼貽貝脫脂干粉的成分分析

脫脂后厚殼貽貝干粉的主要化學成分見表1。由表1可知，厚殼貽貝干粉中主要化學成分為蛋白質，高達78.90%，為蛋白酶的高酶解效率提供了可能。同時，多糖含量較高，但考慮多糖的去除會導致大量蛋白質的損失，因此，選擇在酶解工藝結束后再去除。

表1 厚殼貽貝脫脂干粉的主要化學成分

2.2 酶解物的DH與抗氧化活性的關系

通過堿性蛋白酶在底物濃度［S］4.0%，［E］/［S］為2.0%條件下水解4h，用pH-stat法測量和計算DH，并制備不同DH的酶解產物，測定其還原力A700，進而探討DH對抗氧化活性的影響，結果如圖1所示，其水解進程曲線如圖2所示。

圖1 酶解物的DH與抗氧化活性的關系

圖2 堿性蛋白酶水解厚殼貽貝蛋白的進程曲線

比較DH與還原力A700的關系可知，隨著DH的增加，酶解產物的抗氧化活性呈現上升的趨勢，DH與還原力A700呈現較一致的關系，因此一定程度上講，DH可以較好地衡量酶解物的抗氧化活性。

由酶解進程曲線可知，厚殼貽貝蛋白的DH隨酶解時間延長而逐漸增大，酶解最初1h，DH增加較明顯，1h后變緩;這可能是由于隨酶解進行底物濃度減小，產物濃度增加，競爭性抑制變強，酶活降低等原因造成的。綜合考慮成本與效率等因素，確定酶解反應時間為2h。

2.3 Alcalase2.4L酶解厚殼貽貝蛋白條件的優化

2.3.1 單因素試驗

2.3.1.1 底物濃度［S］對DH的影響

選用 Alcalase2.4L 在［E］/［S］2.0%、pH8.5、50℃條件下水解2 h，對比了不同的底物濃度［S］對DH的影響，其水解進程曲線如圖2所示。

圖3 不同底物濃度的厚殼貽貝蛋白水解進程曲線

由圖3可知，隨著水解的進行，水解度總趨勢逐漸增加，［S］在1.6% ～4.0%的水解進程曲線有交叉，各條件對水解程度影響不明顯，［S］為3.2%時DH稍高于其它水平，當［S］增加到4.8%時，反應速度明顯降低，這可能是因為底物濃度過高使水的有效濃度降低，影響分子的擴散運動，對酶促反應起抑制作用［14］。綜合考慮各因素，［S］選取3.2%。

2.3.1.2 酶和底物濃度比［E］/［S］對DH的影響

選用 Alcalase2.4L 在［S］4.0%、pH 值 8.5、50℃條件下水解2 h，對比了不同的［E］/［S］對DH的影響，其水解進程曲線如圖4所示。

圖4 不同［E］/［S］的厚殼貽貝蛋白水解進程曲線

從圖4可知，隨著［E］/［S］的增加，Alcalase2.4L對厚殼貽貝蛋白的作用增強，水解速度加快。但當［E］/［S］由2.0%遞增到2.5%時，它對厚殼貽貝蛋白的水解作用增加幅度逐漸減弱，此時酶分子趨向飽和，繼續增大加酶量將對反應速率貢獻不大。綜合考慮效率與成本，選擇［E］/［S］為1.5% ～2.5%比較適宜。

2.3.1.3 溫度對DH的影響

Alcalase2.4L對底物的最適作用溫度一般在40～60℃。選用 Alcalase2.4L 在［S］4.0%、［E］/［S］2.0%、pH值8.5條件下水解2 h，對比了不同的溫度對DH的影響，其水解進程曲線如圖5所示。

圖5 不同溫度的厚殼貽貝蛋白水解進程曲線

由圖5可知，隨著溫度的逐漸升高，Alcalase2.4L對底物的水解作用逐漸增強，DH隨溫度的升高而增加變化顯著，因此酶解最適溫度在50～60℃。

2.3.1.4 pH值對DH的影響

選用 Alcalase2.4L 在［S］4.0%、［E］/［S］2.0%、50℃條件下水解2h，對比了不同pH對DH的影響，其水解進程曲線如圖6所示。

圖6 不同pH的厚殼貽貝蛋白水解進程曲線

由圖6可知，隨著時間的延長，水解度總趨勢逐漸增加，并且隨pH值的增加，水解程度越來越大?？紤]工業上的可行性和減少水解液中鹽的含量，因此，選擇酶解最適pH值為8.0～9.0。

2.3.2 響應面法優化

2.3.2.1 實驗設計及結果

由單因素試驗發現，［S］對 DH影響不明顯，［E］/［S］、溫度和pH值對DH都有明顯的影響，以還原力為響應值，采用RSM法來尋求酶解最優工藝參數。利用Design-Expert 6.0.5 Trial軟件，設計得因素水平編碼見表2。試驗設計及結果見表3。

表2 因素水平表

表3 響應面設計方案和試驗結果

表4 還原力的試驗結果方差分析表

圖7 pH、溫度及其相互作用對還原力影響的響應面及等高線圖

2.3.2.2 回歸分析

對試驗結果進行二次回歸擬合，計算各項系數并進行方差分析(見表4)，剔除不顯著因子可得厚殼貽貝酶解物還原力Y的回歸方程為:

Y=0.58+0.036A+0.033B+0.042C－0.057A2－0.072B2－0.053C2－0.029AB－0.034 BC

由表4的方差分析結果可以看出，所得Y的回歸方程極顯著，且失擬項不顯著，這說明此回歸模型很理想，用方程Y擬合3個因素與酶解物的還原力是可行的;同時R2較高，也能夠證明回歸方程與實際數據之間具有非常好的擬合性。從因素A、B、C對還原力的影響來看，方程的一次項A、B和C以及二次項A2、B2和C2均是極顯著的，且影響順序依次為C＞A＞B;交互項中的AB和BC也對還原力有顯著的影響，AC影響不顯著。這說明響應值的變化十分復雜，各個具體的試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是呈二次關系。

分別將模型中的A、B及C中的其中一個因素固定在0水平，得到另外2個因素交互作用對還原力Y的子模型，根據模型繪制三維曲面圖及等高線圖，見圖6。通過分析計算得到最佳酶解條件為:［E］/［S］2.12%、pH值8.66，溫度55.54℃，此條件下還原力的理論值為0.591。

圖8 pH值、［E］/［S］及其相互作用對還原力影響的響應面及等高線圖

圖9 溫度、［E］/［S］及其相互作用對還原力影響的響應面及等高線圖

2.3.2.3 驗證試驗

采用上述優化工藝參數進行試驗驗證，重復3次，實際測得還原力為0.587，與理論預測值的誤差在±1%以內，說明采用RSM優化得到的酶解工藝參數準確可靠，具有實用價值。

2.4 優化條件下厚殼貽貝酶解物清除自由基的能力

通過Alcalase2.4L在優化條件下制備厚殼貽貝酶解物，進而測定其DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除率，從而探討該酶解物清除自由基的能力，結果如圖7所示。由圖7可知，該優化條件下制備得酶解物具有顯著清除DPPH自由基的活性和較強的超氧陰離子自由基清除能力。

圖10 酶解物對2種自由基的清除活性

3 結論

通過考察堿性蛋白酶Alcalase2.4L對厚殼貽貝蛋白的水解能力，在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法確定了Alcalase2.4L水解厚殼貽貝蛋白的最佳工藝條件為［E］/［S］2.12%、pH 值 8.66，溫度55.54℃，［S］3.20%，時間2h。該條件下制備的厚殼貽貝酶解物的還原力為0.587，同時還具有顯著的清除DPPH自由基活性和較強的清除超氧陰離子自由基的能力。

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Study on Hydrolysis of Mytilus coruscus Protein with Alcalase Protease

Dai Zhi-yuan，Zhang Ting，Zhang Yan-ping，Lu Yan-bin，Zhang Yan-ping
(Institute of Aquatic Products Processing，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310012，China)

Alcalase2.4L were applied to hydrolyze the Mytilus coruscus protein.Based on the results of singlefactor tests，reducing power A700was chosen as the response values.Using Response Surface Methodology(RSM) ，the optimum enzyme hydrolysis conditions of Alcalase2.4L to achieve the maximum antioxidant ability were as follows:substrate concentration(［S］)3.20%，［E］/［S］2.12%，enzymolysis temperature 55.54℃，and enzymolysis time 2 hours.Under such conditions，reducibility of the hydrolysate reached 0.587，which also had strong scavenging activity of DPPH radical and superoxide anion radical.

mytilus coruscus，enzymatic hydrolysis，antioxidation，response surface methodology

學士，教授。

*浙江省廳市會商項目(2008C02013)

2010－04－08，改回日期:2010－05－25