雙酶復合水解對玉米肽抗氧化活性的影響*

王曉杰，鄭喜群，劉曉蘭，崔力

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省普通高校農產品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾，161006)

雙酶復合水解對玉米肽抗氧化活性的影響*

王曉杰，鄭喜群，劉曉蘭，崔力

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省普通高校農產品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾，161006)

采用4種蛋白酶(Neutrase酶、Alcalase酶、Protamex酶、Flavourzyme酶)對高底物濃度(24%)玉米黃粉進行雙酶復合水解，研究復合水解對玉米蛋白酶解效率及玉米肽抗氧化活性的影響。結果表明，雙酶復合水解可有效提高玉米蛋白的酶解效率，尤其是Flavourzyme酶與Alcalase酶復合，可使水解度提高26.85%，但酶解效率與抗氧化活性之間無直接對應關系。雙酶復合水解對羥基自由基清除率影響較小，清除率均在90～100%范圍內，與5%VC溶液的清除率相當;對DPPH自由基和超氧陰離子清除率影響較大，且兩者的變化規律相反。

玉米肽，雙酶，抗氧化活性

據美國農業部統計，2009年世界玉米總產量約為7.94億t，同年我國玉米總產量約為1.6億t，產量僅次于美國，是全球第二大玉米生產國和消費國。玉米中含有64%～78%的淀粉，是生產淀粉最為理想的原料。目前，我國對玉米的深加工一般均指玉米所含淀粉的深加工，產品包括淀粉、淀粉糖和變性淀粉等。采用濕法生產淀粉時，可以分離出占玉米干基6%左右的副產物——玉米黃粉(corn gluten meal，CGM)。玉米黃粉中約含62% ～71%的蛋白質，其主要組分是玉米醇溶蛋白(65% ～68%)和谷蛋白(22% ～33%)，還有少量的球蛋白(1.2%)和白蛋白［1］，是濕法玉米淀粉加工中產量最大、蛋白質含量最高的副產物。玉米蛋白具有的氨基酸組成不平衡、水溶性差等特點，限制了其在食品工業中的應用，目前主要作為飼料使用。但是，與其他谷物蛋白相比，玉米蛋白含有高比例的亮氨酸(19.3% ～21.1%)、丙氨酸(8.3% ～10.5%)、異亮氨酸(5.0% ～6.2%)、脯氨酸(9.0% ～10.5%)等疏水性脂肪族氨基酸［2］，且在其多肽鏈中存在著不同的功能區，這些因素為玉米蛋白功能性質的表現提供了良好的原料優勢。研究表明，采用酶法改性技術可將玉米蛋白的功能性質釋放出來。改性后的玉米蛋白除具有高溶解性、低粘度等物化性質外，還具有降血壓［3］、抗氧化［4］、消除疲勞［5］、促進乙醇代謝［6－7］等生理活性。但采用單酶對玉米蛋白進行改性時，存在原料利用率低、生理活性弱等缺點，水解度仍處于相對較低的水平。本實驗利用蛋白酶催化特異性位點的不同，采用雙酶復合水解的方法，在提高玉米蛋白酶解效率的同時，分析了雙酶復合作用對玉米肽體外抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米黃粉，由黑龍江省青岡縣淀粉廠提供;Neutrase酶、Flavourzyme酶、Alcalase酶和 Protamex酶，均購自丹麥諾維信公司。

1.2 試劑

DPPH和VC為Sigma產品，其他試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器

TV1901紫外可見分光光度計，北京譜析通用儀器有限公司;水浴振蕩器，上海躍進醫療器械廠;pH計，上海雷磁儀器廠。

1.4 實驗方法

水解度的測定:pH －Stat法［8］。

超氧陰離子清除率的測定:鄰苯三酚自氧化法［9］。羥基自由基清除率的測定:參照文獻［10］。DPPH自由基清除率的測定:參照文獻［10］。

1.5 蛋白酶的最適酶解條件

在高底物濃度(24%)下，Alcalase酶:E∶S=3%、60℃、pH 值 8.5、2 h;Neutrase 酶:E∶S=1%、45℃、pH 值 7.0、3 h;Flavourzyme酶:E∶S=5%、50℃、pH 值6.0、1 h;Protamex酶:E∶S=1%，50 ℃，pH 值 7.0，3 h。

2 結果與討論

2.1 Alcalase酶與其他蛋白酶復合水解對玉米肽抗氧化活性的影響

第一階段水解采用Alcalase酶(簡寫A酶)，在其最適酶解條件下水解2 h后，分別加入Flavourzyme酶(簡寫F酶)、Neutrase酶(簡寫N酶)、Protamex酶(簡寫 P 酶)，再分別水解1 h、3 h、3 h，均以第二階段不加酶作為對照。實驗過程中按一定時間調整反應初始pH值，測定玉米蛋白的水解度。水解完成后，水解液在沸水浴中滅酶活5 min，于5000r/min條件下離心10 min獲得玉米肽的混合物。測定玉米肽對羥基自由基、超氧陰離子和DPPH自由基的清除率，實驗結果如圖1、圖2所示。

圖1 Alcalase酶與其他酶復合對水解度的影響

圖2 Alcalase酶與其他酶復合對自由基清除率的影響

從圖1可以看出，在水解初期，Alcalase酶解反應速度很快，隨后逐漸減慢，到2 h時反應基本停滯。再分別加入F酶和P酶，水解度迅速提高后又趨于平緩，與 Alcalase單酶水解相比水解度增加了8.39%。由于Alcalase酶水解專一性強，在其最適條件下水解2 h后，會暴露出較多利于F酶和P酶的酶解位點，所以水解度提高的幅度較大。而N酶的加入并未使水解度有效地提高，甚至較Alcalase單酶水解時略低，原因是第一階段添加的Alcalase酶在新的條件下又重新水解玉米蛋白，且其催化效率高于N酶，從而抑制了N酶的催化活性。

玉米蛋白中含有較多的疏水性氨基酸，而Alcalase酶是一種內切肽酶，優先水解疏水性的、分子量較大蛋白質或肽段，可以制備出末端具有疏水性氨基酸的短肽。由于肽的抗氧化活性與疏水性氨基酸有關 ，所以玉米蛋白經Alcalase酶改性后，水解產物具有體外抗氧化活性。又由于第二階段加入的蛋白酶具有不同的底物專一性，導致酶解液中肽段的種類和數量均不同，因而玉米肽具有不同的體外抗氧化活性。由圖2可以看出，第二階段加入P酶和N酶，可以使玉米肽的體外抗氧化活性提高，尤其是超氧陰離子清除率，分別提高了10.53%和6.26%。原因是肽的抗氧活性與產物中肽含量及其分子質量有明顯的相關性［11］，P酶和N酶在Alcalase酶的基礎上，繼續酶解反應體系中的大片段，使多肽鏈進一步變短，反應體系中肽含量增加，玉米肽的抗氧化活性增強。第二階段加入F酶使DPPH自由基清除率提高19%，而超氧陰離子清除率卻降低1.61%。原因是F酶具有的外切酶催化活性，將出現在肽鏈末端的具有抗氧化活性的氨基酸如Val、Leu又水解掉，使清除能力降低。也可以說明F酶對Alcalase酶的水解物起到再作用的效果。

2.2 Neutrase酶與其他蛋白酶復合水解對玉米肽抗氧化活性的影響

第一階段水解，采用N酶，在其最適酶解條件下水解3h后，分別加入F酶、Alcalase酶、P酶，再分別水解1、2、3 h，其余操作同2.1，實驗結果如圖 3、圖4所示。

圖3 Neutrase酶與其他酶復合對水解度的影響

圖4 Neutrase酶與其他酶復合對自由基清除率的影響

從圖3可以看出，N酶對玉米蛋白水解3 h后，可使玉米蛋白高級結構發生部分改變，包埋在蛋白質內部的酶解位點暴露出來，加入第2種蛋白酶后，水解度呈遞增趨勢。由于各種蛋白酶的催化特異性及作用位點的差異，水解度的增加幅度不同。其中，第二階段加入Alcalase酶使水解度的提高幅度最大，與N單酶水解相比提高了23.90%。N酶與P酶復合使酶解效率提高幅度較小，可能是因為兩者均為作用位點廣泛的蛋白酶，在水解過程中競爭作用位點，使后續酶作用效果較差。

由圖4可以看出，N酶單酶水解時，玉米肽對羥基自由基的清除率達100%，與5%Vc溶液的清除率相當;對DPPH自由基也具有很強的清除能力，清除率可達83%，但其對超氧陰離子清除率僅為0.71%。第二階段加入Alcalase酶，酶解效率大幅度提高，肽鏈長度變短，使一些具有抗氧化活性的氨基酸出現在肽鏈末端，羥基自由基和超氧陰離子清除率提高。又由于Alcalase酶酶解效率高，水解液顏色呈墨綠色，相同體積的樣液對DPPH自由基清除時的顏色反應有干擾，導致DPPH自由基清除率降低了59%。第二階段加入F酶，其外切酶活性使超氧陰離子和羥基自由基清除率明顯降低，但對DPPH自由基清除率略有提高，說明發揮DPPH自由基清除能力的可能是一些具有抗氧化活性的游離氨基酸，而末端帶有疏水性氨基酸和堿性氨基酸的肽段具有超氧陰離子清除能力。

2.3 Protamex酶與其他蛋白酶復合水解對玉米肽抗氧化活性的影響

第一階段水解，采用P酶，在最適酶解條件下水解3h后，分別加入F酶、N酶、Alcalase酶，再分別水解1、3、2 h，其余操作同 2.1，結果如圖5、圖6 所示。

圖5 Protamex酶與其他酶復合對水解度的影響

從圖5可以看出，雙酶復合水解時，水解度總體呈遞增趨勢，提高的幅度取決于第二階段添加蛋白酶的種類。其中，P酶與Alcalase酶復合效果最好，可使水解度提高21.63%，水解產物抗氧化活性的變化規律與N酶和其他蛋白酶復合時相同?？赡苁怯捎赑酶與N酶均為中性蛋白酶，在作用位點上存在著相似性，所以和相同的蛋白酶復合后，水解產物的抗氧化活性呈相同的變化趨勢。

2.4 Flavourzyme酶與其他蛋白酶復合水解對玉米肽抗氧化活性的影響

第一階段水解，采用F酶，在其最適酶解條件下水解1h后，分別加入P酶、Alcalase酶和N酶，再分別水解3、2和3 h，其余操作同2.1，實驗結果如圖7、圖8所示。

圖6 Protamex酶與其他酶復合對自由基清除率的影響

圖7 Flavourzyme酶與其他酶復合對水解度的影響

圖8 Flavourzyme酶與其他酶復合對自由基清除率的影響

由圖7可知，在F酶水解反應基本停滯時，分別加入P酶、Alcalase酶和N酶，只有Alcalase酶能有效地提高玉米蛋白的酶解效率，其他蛋白酶效果不明顯?？赡苁怯捎贔酶解效率低，作用玉米蛋白1 h后，未能使玉米蛋白高級結構發生有效的改變或改變的幅度較小，第二階段再加入同樣酶解效率相對較低的N酶和P酶，未能使酶解效率有效地提高。

由圖8可以看出，F酶單酶水解時，玉米肽對羥基自由基和 DPPH自由基清除率較高，分別達到95.13%和84.93%，但其對超氧陰離子的清除能力卻為0。原因是F酶解效率低，酶解產物中肽段過長，具有抗氧化活性的一些氨基酸未能出現在肽鏈的N-末端或C-末端，超氧陰離子的清除能力顯示不出來。第二階段加入Alcalase酶，雖使酶解效率大幅度提高，但未能有效地提高玉米肽的抗氧化活性;而P酶和N酶雖酶解效率低，但對玉米肽抗氧化活性的提高有明顯促進作用，尤其是與P酶復合后，超氧自由基清除率提高了12.85%，與0.5%Vc溶液的清除能力相當。說明抗氧化活性與酶解效率之間無直接對應關系，并不呈現酶解效率越高抗氧化活性越高的變化規律?？寡趸钚噪挠商厥獍被嵝蛄薪M成，只有在特定的水解度范圍內才能表現出抗氧化活性。

3 結論

雙酶復合水解可有效提高玉米蛋白的酶解效率，且酶解效率與抗氧化活性之間無直接對應關系。雙酶復合水解對羥基自由基清除率影響較小，超氧陰離子和DPPH自由基清除效果影響較大，且兩者的變化趨勢相反。其中，F酶可有效提高玉米肽DPPH自由基親清除率，P和N酶對超氧陰離子清除率的提高有促進作用。所以，在玉米肽加工中可以針對不同自由基的要求，選用不同的蛋白酶組合對玉米蛋白進行改性，以制備出具有高抗氧化活性的玉米肽。

［1］ Magoichi Y，Masayasu T，Osamu N，et al.Preparation of corn peptide from gluten meal and its administration effect on alcohol metabolis in stroke-prone spontaneously hypertensive rats［J］.J Nutr Sci Vitaminol，1996，42:219 －231.

［2］ Pomes A F.Zein［M］.London:Interscience Publisher，1971:125－132.

［3］ Kim J M，Whang J H，Suh H J.Enhancement of angiotension I converting enzyme inhibitory activity and improvement of the emulsifying and foaming properties of corn gluten hydrolysate using ultrafiltration membranes［J］.Eur Food Res Technol，2004，218:133 －138.

［4］ 張強，闞國仕，陳紅漫.玉米抗氧化肽的分離制備及其體外抗氧化活性的研究［J］.中國糧油學報，2005，20(5):36－39.

［5］ 陳紅漫，杜國豐，田秀艷，等.脫色素玉米活性肽對小鼠抗運動性疲勞的影響［J］.江蘇農業學報，2009，25(9):592－595.

［6］ 隋玉杰，何慧，石燕玲，等.玉米肽的醒酒活性體外試驗及其醒酒機理研究［J］.中國糧油學報，2008，25(3):54－58.

［7］ Yamaguchi M，Nishikiori F，Ito M，et al.Effect of corn peptide on alcohol metabolism and plasma free amino acid concentrations in healthy men［J］.Eur J Clin Nutr，1996，50(10):682－688.

［8］ Jens A N.Enzymic Hydrolysis of Food Proteins［M］.London and New York:Elsevier Applied Science Publishers，1986:122－144.

［9］ 謝衛華，姚菊芳，袁勤生.鄰苯三酚氧化法測定SOD活性［J］.醫藥工業，1988，19(5):217－219.

［10］ 賈俊強，馬海樂，曲文娟，等.超聲波處理大米蛋白制備抗氧化肽［J］.農業工程學報，2008，24(8):288－293.

［11］ 王嘉榕，騰達，田子罡，等.功能性抗氧化肽制備與機制研究進展［J］.天然產物研究與開發，2008，20(2):371－375.

The Effect of Double Proteases Multi-hydrolysis on Antioxidant Activities of Corn Peptides

Wang Xiao-jie，Zheng Xi-qun，Liu Xiao-lan，Cui Li
(Heilongjiang Key Laboratory of Agricultural Products Processing，College of Food and biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China)

The proteases(Neutrase，Alcalase，Protamex，Flavourzyme)were used to perform multi-hydrolysis of high corn gluten meal concentration(24%)，and the effects of double proteases on hydrolysis efficiency of corn protein and antioxidant activities of corn peptides were studied.The result showed that the hydrolysis efficiency of double proteases was better than that of single protease，and Flavourzyme combining with Alcalase was the optimal design.In this condition，the degree of hydrolysis was increased 26.85%.The efficiency of hydrolysis was not positive correlation to the antioxidant activities of corn peptides.The scavenging rate of hydroxyl radical was 90% ～100%，equivalent to the effect of 5%Vitamin C solution.The multi-hydrolysis of double proteases had an obvious influence on the clearance rate of superoxide anion and DPPH radical of corn peptides，while the changes in the clearance rate of superoxide anion were contrary to that of DPPH radical.

corn peptide，double enzyme，antioxidant activities

碩士，講師(鄭喜群教授為通訊作者)。

*黑龍江省自然科學基金(B200919)，黑龍江省教育廳海外學人

科研資助項目(1153h24)

2010－04－15，改回日期:2010－05－19