低鹽固態醬油淋澆發酵工藝優化*

陳敏，蔣予箭，沈忱，張海珍

(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州，310035)

低鹽固態醬油淋澆發酵工藝優化*

陳敏，蔣予箭，沈忱，張海珍

(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州，310035)

以豆粕、麩皮為原料，對低鹽固態醬油淋澆發酵工藝參數進行優化。以一淋原油中氨基酸態氮含量為評價指標，開展了發酵溫度、鹽水濃度和淋澆周期單因素試驗。在此基礎上，采用Box-Benhnken響應面分析法，設計了3因素3水平試驗，通過SAS軟件分析得到回歸模型并進行了方差分析，優化的工藝參數為:發酵溫度43.1℃，鹽水濃度為14.8°Bè，淋澆周期為2.5 d/次。在此工藝下一淋原油中氨態氮含量達到11.4 g/L，與回歸模型的預測值相對誤差僅0.88%，回歸方程與實際情況擬合較好。

醬油，低鹽固態發酵，淋澆，氨態氮，響應面法

醬油是以大豆、小麥、麩皮等為原料經過米曲霉制曲，拌鹽水發酵釀制成的糧油深加工品，現行的生產工藝主要包括低鹽固態發酵工藝和高鹽稀態發酵工藝2種。低鹽固態發酵工藝因設備投資低、生產周期短等特點，目前主導著中低端醬油產品的生產。但與高鹽稀態發酵工藝相比，產品風味稍欠缺，如何提高低鹽固態釀造醬油的風味是行業十分關注的課題［1］。淋澆發酵是采用重復將發酵池底的醬汁回淋于醬醅面層，可達到改善醬油風味，提高醬油得率及品質的目的［2－4］。近年來，一些醬油生產企業先后注意到了淋澆發酵工藝在提高低鹽固態醬油出品率及改善醬油品質方面的作用，開始進行生產性試驗或應用。但由于對具體工藝參數的認識及控制上的差異，應用效果差異很大。因而開展低鹽固態醬油淋澆工藝的系統研究，將對醬油生產企業起到指導作用。

本試驗以淋澆發酵釀造醬油一淋原油中氨基酸態氮(ammoniacal acids content，AN，簡稱氨態氮)的含量作為考察低鹽固態釀造醬油淋澆發酵工藝的主要指標。在淋澆發酵溫度、鹽水濃度和淋澆周期單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken響應面分析法，設計了3因素3水平試驗，通過SAS軟件分析得到回歸模型并進行了方差分析和驗證試驗，進行了低鹽固態醬油淋澆發酵工藝參數的優化。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

豆粕、麩皮、食鹽，杭州食品釀造有限公司提供。

滬釀3.042米曲霉，上海迪發釀造生物制品有限公司。

PDA培養基，杭州微生物試劑有限公司。

VS－840－2超凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;YXQ-LS-SⅡ全自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;PHS-3C Precise pH METER酸度計，上海雷磁儀器廠;78HW－1恒溫磁力攪拌器，杭州儀表電機廠;76－1玻璃恒溫水浴缸，常州國華電器有限公司。

1.2 試驗方法

滬釀3.042米曲霉菌種活化:取保存的菌種，接種于馬鈴薯－葡萄糖液體培養基上，28℃，轉速150 r/min，培養時間 72 h。

種曲制備:m(豆粕)∶m(麩皮)∶m(水)=1∶4∶5，121℃滅菌20 min，冷卻后以0.3%量接入活化菌種，30℃，轉速150 r/min，培養時間72 h。

成曲制備:m(豆粕)∶m(麩皮)∶m(水)=6∶4∶5，121℃滅菌20 min，冷卻后以0.3%量接入種曲，在33～35℃下通風培養39 h出曲。

入池發酵:根據試驗設計配制不同濃度的鹽水，m(鹽水)∶m(成曲)=1∶1.5 混合均勻，發酵 20 d，跟蹤測定氨態氮含量。

淋油:發酵結束時，每缸加入同體積80℃的熱水。浸沒固態醬醅表面，靜置12 h后抽提出一淋原油;再加入同體積熱水浸沒固態醬醅表面，靜置4 h后抽提出二油。同時進行氨態氮、全氮、蛋白質利用率指標的測定。

氨態氮測定方法:甲醛滴定法［5］。

全氮測定方法:凱氏定氮法［6］。

蛋白質利用率計算:

蛋白質利用率/%=

式中:m、d、ρN，本次產醬油的實際量、密度、全氮含量;m1、d1、ρn1，借用上次二淋油的量、密度、全氮含量;m2、d2、ρN2，本次產的二淋油的量、密度、全氮含量;mp，混合原料中蛋白質的總量，kg。

1.3 響應面試驗設計［7－10］

通過單因素試驗結果，確定發酵溫度(X1)、鹽水濃度(X2)、淋澆周期(X3)3個因素與氨態氮含量進行響應面試驗設計(表2)，采用SAS8.0對試驗數據進行回歸分析。每一自變量的低、中、高試驗水平分別以－1、0、+1進行編碼，該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程 Y =A0+ΣAiXi+ΣAiiXi2+ΣAijXiXj，其中 Y 為響應值(氨態氮含量) ，A0、Ai、Aii、Aij為方程系數，Xi、Xj(i≠j)為自變量編碼值。多項式模型方程擬合的性質由確定系數R2表達，顯著性采用F檢驗;采用SAS典型性分析預測最大氨態氮含量的發酵條件。

2 結果與討論

2.1 兩種低鹽固態醬油發酵工藝的比較

在 m(成曲)∶m(鹽水)=1∶1.5，鹽水濃度為 15°Bè，發酵溫度42～45℃條件下，分別采用低鹽固態發酵工藝與低鹽固態淋澆發酵工藝，以玻璃恒溫水浴缸進行保溫發酵，共發酵5批次。分析對照2種工藝條件下釀造醬油的氨態氮指標與蛋白質利用率，結果如表1。

表1 兩種工藝條件所得醬油理化指標的比較

表1表明，2種工藝下醬油一淋原油氨態氮含量差異顯著，原料蛋白質利用率差異極顯著。淋澆工藝下，醬油一淋原油的氨態氮含量和原料蛋白質利用率均比對照組高，氨態氮含量較對照組提高21%，蛋白質利用率比對照組提高13.7%?？梢?，采用淋澆工藝改善低鹽固態釀造醬油的質量、提高工廠經濟效益的效果是明顯的。

2.2 淋澆發酵工藝參數的單因素試驗

2.2.1 發酵溫度的優化

發酵溫度與醬醅中蛋白質的水解速度和水解程度密切相關，還會影響雜菌的生長情況，在較低溫度下進行發酵，容易使醬醅酸敗。試驗考察了33、38、43、48和53℃對淋澆醬油一淋原油氨態氮的影響，見圖1。由圖1可見，發酵溫度為43℃，有利于蛋白質的分解，氨態氮含量最高。

圖1 發酵溫度對醬油中氨態氮含量的影響

2.2.2 鹽水濃度的優化

向成曲拌入鹽水的主要作用是防止發酵過程醬醅的雜菌污染，但過高的鹽水濃度會抑制蛋白酶的作用，使得發酵時間延長。本試驗考察了9、12、15、18、21°Bè鹽水對淋澆醬油一淋原油AN的影響，結果見圖2。試驗結果表明，鹽水濃度在15°Bè時一淋原油中的AN含量最高，在該鹽水濃度下成曲中蛋白質分解最好，氨態氮形成最高。

圖2 不同鹽水濃度對醬油氨態氮含量的影響

2.2.3 淋澆發酵周期的優化

淋澆的目的主要是:(1)使醬醅保持在濕潤的狀態，(2)使醬醅溫度保持均勻。對于不淋澆的低鹽固態發酵工藝，上層醬醅到了發酵后期常由于水分過低，蛋白質水解不充分，原料利用率偏低。本試驗考察了1、2、3、4、5 d的淋澆周期對一淋醬油中氨態氮的影響。試驗結果表明，淋澆周期為2 d時，醬油的氨態氮含量較高，質量較好。同時試驗中發現，由于低鹽固態淋澆發酵工藝醬醅表面沒有覆面鹽，若淋澆周期＞3 d，醬醅表面容易長出白色的霉狀物。

圖3 不同淋澆周期對醬油氨態氮含量的影響

3 響應面法對淋澆發酵工藝條件進行優化

3.1 Box-Behnken試驗設計的因素與水平

根據單因素試驗結果，選取單因素試驗的最優點為中心，采用響應曲面法中的Box-Behnken試驗設計研究優化低鹽固態醬油淋澆工藝。根據Box中心組合設計原理，設計了3因素3水平的響應面分析試驗。共有15個試驗點，其中12個為析因子，3個為0點，以估計誤差。以氨態氮含量為響應值(Y)，試驗設計及結果見表2和表3。

表2 Box-Behnken試驗設計的因素與水平

表3 響應面中心組合試驗設計及結果

3.2 回歸模型的建立和方差分析

運用SAS軟件對響應值進行回歸分析，經擬合得到回歸預測模型為:

Y=1.139 867 －0.002 988 X1－0.006 163 X2+0.302 00 X3－0.046 021 X12－0.025 975 X2X1－0.084 521 X22+0.007 050 X3X1－0.011 700 X3X2－0.031 546 X32，回歸方程的方差分析見表4和表5。

表4 回歸方程的方差分析

表5 回歸系數取值及分析結果

從表3和表4可看出，該回歸方程的一次項顯著，二次項非常顯著，說明各個試驗因素對響應值的影響是二次拋物線的關系。整體模型的“Prob＞F”值小于0.05，表明該二次方程模型比較顯著;R2=0.943 8，說明這種試驗方法是可靠的，能夠很好地描述試驗結果，使用該方程進行真實的試驗點分析是可行的?；貧w系數顯著性檢驗表明，在所選取的各因素水平范圍內，對低鹽固態一淋原油氨態氮影響的排序依次為:鹽水濃度＞發酵溫度＞淋澆周期。

3.3 響應曲面圖分析

根據回歸結果作出相應曲面圖，結果見圖4～圖6。

圖4是在鹽水濃度處于中心點(15°Bè)時，其他2因素的交互作用體現。由圖4可知，同一發酵溫度下，氨態氮含量隨著淋澆周期的延長呈先增加后減少的趨勢。原因是適當的淋澆周期有利于制曲時產生的蛋白酶與底物的充分接觸，還可促進空氣中耐鹽酵母和乳酸菌在醬醅中的生長繁殖，改善醬油風味。若淋澆周期過長，醬醅中蛋白質分解速度減緩，醬油風味變差;而淋澆周期過短，會導致雜菌增殖過快，消耗醬醅中已分解的原料，導致一淋原油氨態氮偏低。

圖5是在淋澆周期處于中心點(2 d/次)時，其它2因素的交互作用體現。由圖5可知隨著發酵溫度的增加，氨態氮含量在45℃附近時達到最高值，且回歸方程中發酵溫度和鹽水濃度的一次項和二次項均顯著(P＜0.05)。說明發酵溫度與鹽水濃度的交互作用顯著。

圖6是在發酵溫度處于中心點(45℃)時，其他2因素的交互作用體現。由圖6可知，同一淋澆周期時，氨態氮含量隨著鹽水濃度的增加呈先增加后減少的趨勢。分析原因應是鹽水濃度較低，雜菌生長較容易，消耗醬醅中蛋白質物質，導致一淋原油中氨態氮偏低。若鹽水濃度偏高，雖較好抑制了雜菌的生長，但不利于醬渣中蛋白酶的催化，延緩了原料的分解利用，在相同的發酵時間內，氨態氮含量達不到較高的水平。

3.4 發酵工藝條件的確定與驗證

通過軟件分析，低鹽固態淋澆發酵工藝的最佳參數為發酵溫度43.2℃，鹽水濃度為14.8°Bè，淋澆周期2.5 d/次。在此工藝條件下氨態氮含量的理論值是1.15 g/100 mL。為檢驗響應面法的可靠性，采用上述發酵參數作3組平行驗證試驗，實際測得值為(1.14±0.006 7)g/100 mL，理論值與實際值的相對誤差在0.88%左右，差異不顯著。因此，采用響應面法優化得到的低鹽固態醬油的淋澆工藝參數準確可靠，具有實用價值。

圖4 溫度與淋澆周期交互影響氨態氮含量的曲面圖

圖5 溫度與鹽水濃度交互影響氨態氮含量的曲面圖

圖6 鹽水濃度與淋澆周期交互影響氨態氮含量的曲面圖

4 結論

通過單因素試驗確定了影響低鹽固態醬油淋澆工藝一淋原油氨態氮的各因素水平范圍，采用Box-Behnken 3因素3水平試驗設計優化因素水平，應用SAS軟件對試驗結果進行分析，得出以醬油一淋原油氨態氮為指標的最優的淋澆工藝參數，即發酵溫度43.2℃，鹽水濃度為 14.7°Bè，淋澆周期 2.5 d/次。經過驗證試驗，實際測得的一淋原油中氨態氮含量平均為 11.4 g/L，與理論預測值的相對誤差僅為0.88%左右，因此，采用響應面法優化得到的方程能較好的模擬試驗結果，優化得到的淋澆工藝參數具有較強的應用價值。

［1］ 林祖申.提高低鹽固態發酵醬油質量風味的研究與探討［J］.中國釀造，2001(6):1－4.

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Optimization of Spraying Extraction Process Parameters for Soy Sauce Under Low Salt and Solid State Fermentation Using Response Surface Methodology

Chen Min，Jiang Yu-jian，Shen Chen，Zhang Hai-zhen
(College of Food Science and Bioengineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China)

In this paper，the process parameters of low-salt and solid-state fermentation with Spraying-extraction were investigated by using soybean，bran as raw material.The variation range of parameters was determined by single factor experiment.Then three factors such as temperature，concentration of brine and spraying-extraction cycle were optimized by response surface method.Using amino acids contents as the response value，the effects of various factors were estimated through variance analysis and response surface analysis.The results showed that optimum fermentation temperature，concentration of brine and spraying-extraction cycle were 43.1℃，14.8°Bè，2.5 days，respectively.Under these conditions，the amino acids content of soy sauce was 1.14g/100 mL.The experimental values agree with those predicted from the regression model within a relative error of 0.88%，indicating a good fitness.

soy sauce，low-salt and solid-state fermentation，spraying-extraction，amino acids contents，response surface methodology

碩士，副教授。

*浙江省科技計劃項目(2007C22001)

2010－03－19，改回日期:2010－06－21