不同酶切方式對乳清蛋白疏水性和乳化性的影響

韓仁嬌，劉春紅，馮志彪（東北農業大學.食品學院；.應用化學系，哈爾濱150030）

不同酶切方式對乳清蛋白疏水性和乳化性的影響

韓仁嬌a，劉春紅b，馮志彪b
（東北農業大學a.食品學院；b.應用化學系，哈爾濱150030）

采用不同的蛋白酶對乳清蛋白進行水解，考察了肽鍵斷裂方式對乳清蛋白肽疏水性和乳化性的影響，以及乳清蛋白不同酶解產物的疏水性和乳化性的關系。結果表明：不同蛋白酶作用于乳清蛋白得到的水解產物疏水性不同，6種蛋白酶解液的疏水性均隨水解度的增大而降低，其中以胰凝乳蛋白酶酶解液的疏水性下降的最慢。研究還發現，乳化性隨著水解度增加而先升高后下降，以雙酶復合酶解液最差。不同蛋白酶水解液的乳化性指數隨疏水性指數的降低而升高，乳化性指數與疏水性氨基酸質量分數成正相關。

乳清蛋白；酶解；水解度；疏水性；乳化性

0 引 言

乳清蛋白是干酪加工過程中所產生的副產品，再經過特殊工藝濃縮精制而得到的一類蛋白質。由于其天然結構較大，直接食用利用率較低[1,2]。如果將乳清蛋白經適當的酶解，不僅其相應的功能性質以及機體利用率可得到改善，且酶解后還可以釋放出乳清蛋白中包含的多種生物活性序列，使其成為具有特殊的生理活性的片段，進而實現對人體的特殊生理功能，如降膽固醇、抗癌、鎮靜等[3-6]。本實驗采用Alcalase蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、雙酶（Alcalase蛋白酶，木瓜蛋白酶）分別對乳清蛋白進行定位水解，并且研究了不同酶解方式對乳清蛋白疏水性和乳化性的影響，以及水解程度與疏水性和乳化性的關系，以進一步拓寬乳清蛋白酶解產物在食品領域的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

乳清分離蛋白 （Whey Protein Isolated,WPI），蛋白質量分數為98%。

蛋白酶（Alcalase蛋白酶），中性蛋白酶（Neutrase），胃蛋白酶（Pepsin），胰蛋白酶（Trysin），胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin），木瓜蛋白酶（Papain）。

大豆油，化學試劑（所用試劑均為分析純）。

1.2 主要儀器設備

UVmini-1240紫外可見分光光度計；F4500熒光分光光度計；冷凍干燥機（FDU-1100）；高速臺式離心機；PHS-3C型pH計；高剪切均質乳化機；氨基酸分析儀A300。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳清蛋白水解

稱取一定量的乳清分離蛋白，按底物質量濃度為50 g/L將其水化，80℃水浴處理15 min，冷卻到每種酶最適的溫度，用濃度為1 mol/L的氫氧化鈉或1 mol/L的鹽酸調到反應所需的pH值后加酶，在恒溫振蕩器中進行水解，水解過程中不斷滴加酸或堿使反應體系維持在初始的pH值，反應結束后置于沸水浴中20 min使酶失活，離心取30 mL上清液進行實驗，其余水解液冷凍干燥待用。

用Alcalase蛋白酶和木瓜蛋白酶進行的雙酶水解，其水解過程為：先在蛋白酶最適的條件下水解，滅活，離心后，取全部上清液，調節到木瓜蛋白酶最適的條件下再進行水解，后續過程同上。

1.3.2 水解度的測定

游離氨基的測定采用鄰苯二甲醛（OPA）法測定水解物游離氨基的濃度[7]。

蛋白質量濃度測定采用凱氏定氮法 （參照GB/T 5009.5-2010）。

式中：h為單位質量蛋白質中被水解的肽鍵的量（mmol/g）；htot為單位質量蛋白質中肽鍵的總量（mmol/g）；乳清蛋白質htot為8.8 mmol/g。

1.3.3 疏水性氨基酸濃度的測定

參照中華人民共和國專業標準 （GB/T14965-1994）采用自動氨基酸分析儀測定。精確稱取20 mg待測樣品于特制的水解管中，加入濃度為6 mol/L優級純鹽酸8 mL，抽真空條件下封口，在110℃的烘箱內水解24 h，取出冷卻后，小心全部轉移至50.00 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，用雙層濾紙過濾，取濾液1.00 mL于25 mL小燒杯中，在真空干燥器中蒸干后（約50℃），殘留物用1～2 mL水溶解，再干燥，反復進行兩次，最后蒸干，用1.00 mL（pH=2.2）的緩沖液溶解，待儀器測定使用。

1.3.4 表面疏水性的測定

采用ANS（1-苯胺基-8-萘磺酸）熒光探針法[8]，取乳清蛋白的不同酶解液用Folin-酚法測定蛋白濃度，并用同一磷酸緩沖液逐步稀釋（濃度約在0.005%～0.1%之間）后，取不同濃度樣品的溶液5.00 mL，分別加入50 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液 （采用0.01 mol/L，pH=7.0的磷酸緩沖液配置），振蕩，靜置3 min，然后測定樣品的熒光強度（FI）。本實驗中，激發波長λex=338 nm，發射波長λem=496 nm。以熒光強度對蛋白質濃度作圖，初始段斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數（So）。

1.3.5 乳化性的測定

取不同酶解方式的乳清蛋白水解液各20 mL，調節至pH=7.0后加入2 mL食用油，25℃下10 000 r/min攪拌1 min制成乳狀液；在10 000 r/min下離心5 min，用質量分數為0.1%的SDS溶液將上清夜稀釋適當倍數，以SDS溶液作為空白，測定500 nm處吸光度，以乳化性指數EAI表示乳化性；將EAI測定中制備的乳狀液在25℃靜止10 min，測定其乳化性指數EAI′，以乳化穩定性指數ESI表示乳化穩定性[9]。

乳化性指數

式中：EAI為乳化穩定性指數；ESI為乳化穩定性指數；C為肽液中蛋白質質量；Φ為油相體積（0.0566）；Δt為時間間隔。

2 結果與討論

2.1 不同酶解條件對水解度的影響

不同蛋白酶水解乳清分離蛋白的水解情況如表1所示。

表1 不同蛋白酶水解乳清分離蛋白的水解度

由表1可見，在每種酶最適宜的溫度和pH條件下，雙酶（Alcalase蛋白酶與木瓜蛋白酶）對乳清分離蛋白的水解度最大，達到26.57%，其次為Alcalase蛋白酶，水解度達到22.05%，其主要原因是Alcalase蛋白酶屬于堿性蛋白酶，乳清蛋白在堿性溶液中的溶解性比較大，在酸性及中性條件下溶解度次之，這樣大大提高了酶與蛋白質之間的作用效果。另外，由于酶的種類和來源不同，不同的蛋白酶具有其特定的酶切位點（見表2）[10]，能夠特異性地斷裂蛋白質的肽鍵。

由于Alcalase蛋白酶屬于非特異性蛋白質肽鏈內切酶，且其作用底物廣泛，能水解所有羧基側具有芳香族或疏水性氨基酸，而木瓜蛋白酶可以作用于蛋白質和小分子肽段，切斷的肽鍵與Alcalase蛋白酶水解肽鍵有互補性，因此Alcalase蛋白酶與木瓜蛋白酶聯合作用的水解效果優于Alcalase蛋白酶。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和中性蛋白酶的作用位點不及Alcalase蛋白酶廣泛，所以其水解效果偏低。另外，由于胃蛋白酶屬于酸性蛋白酶，而乳清蛋白在酸性條件下溶解度較低，加之胃蛋白酶僅作用于肽鍵兩端是芳香族氨基酸的肽鍵，所以其水解效果最差。

表2 不同蛋白酶特定的作用位點

2.2 不同酶切位點對疏水性的影響

不同酶切位點下，水解時間對乳清分離蛋白疏水性指數以及疏水性氨基酸含量的影響分別如圖1和圖2所示。

由圖1和圖2可以看出，不同蛋白酶作用于乳清蛋白得到的水解產物水解度不同疏水性也不同，6種蛋白水解液的疏水性均隨水解度的增大而降低，但降低的程度各有不同，其中，胰蛋白酶水解液的疏水性指數隨其水解度的增大，降低的幅度最小。Alcalase蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶水解液的疏水性指數隨其水解度的增大降低的幅度較大。不同酶處理液中疏水性氨基酸質量分數均隨水解度的增大而提高；其中，Alcalase蛋白酶、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解液中疏水性氨基酸質量分數隨其水解度的增大升高的較快。這主要是因為不同的酶具有不同的切割位點，切割位點不同，水解后暴露的疏水性氨基酸末端含量不同，Alcalase蛋白酶、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，主要水解含有苯環結構或類似苯環結構的芳香族氨基酸形成的肽鍵，隨著水解的進行，含苯環結構的疏水性氨基酸末端緩慢暴露，而含苯環的芳香族氨基酸大都是疏水性氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）[11]，其水解產物中疏水性氨基酸的含量自然較高，對于主要酶切位點是堿性氨基酸（組氨酸、精氨酸、賴氨酸）羧基端肽鍵的胰蛋白酶而言，其水解產物中疏水性氨基酸含量則較低；另外，隨著水解的進行，水解后形成的肽鏈愈來愈短，空間阻礙較弱，導致肽鏈通過疏水相互作用發生聚集，使得與熒光探針結合的疏水基團減少，進而導致表面疏水性指數呈下降趨勢，在相同時間內，水解程度愈劇烈其疏水性指數下降的趨勢愈明顯，所以，Alcalase蛋白酶與雙酶水解液的疏水性指數下降的幅度較大。另外，在利用ANS熒光探針法測定蛋白水解液的疏水性時，疏水性指數在很大程度上受到蛋白水解物在溶劑中溶解性的影響[12]，乳清蛋白的疏水性水解產物在溶劑或緩沖液中的溶解度不好，不利于熒光探針的滲透，也可能導致其疏水性指數降低。

2.3 不同酶切位點對乳化性的影響

不同酶切位點下，酶解時間對乳清分離蛋白乳化性的影響如圖3和圖4所示。

由圖3和圖4可以看出，不同酶解條件下的乳清蛋白水解物，在水解之初，隨著水解的進行其乳化性和乳化穩定性都有所提高，但隨著水解時間的進一步延長，二者便隨之降低；不同酶處理的水解液的乳化性以雙酶酶解液最差。其主要原因可能是由于在水解之初，隨著蛋白酶水解作用的進行，疏水基團的暴露和端基（-NH2和-COOH）數目增加使電荷數目增加，阻止了油滴的靠近,有利于膠束的形成，進而提高了乳化性和乳化穩定性。但隨著水解的進一步進行，蛋白水解液的乳化性隨之降低，其主要原因可能是由于水解度的增大，維持蛋白質穩定結構的各種作用力，如氫鍵、范德華力等受到破壞，加之肽鏈逐漸縮短，導致其在油水界面的相互作用力減小，乳化球較易破裂，使得乳化能力降低。另外，在水解過程中，隨著水解程度的進一步提高，水解物中形成的聚集物會阻礙油-水界面處粘彈性乳化薄膜的形成，增大了油滴聚集的幾率，從而使乳化穩定性呈下降趨勢[13]。雙酶和Alcalase蛋白酶水解液的乳化性之所以偏低主要是由于Alcalase蛋白酶的水解強度較高，能水解所有羧基側具有芳香族氨基酸或疏水性氨基酸的肽鍵，水解產物主要以小分子肽或氨基酸為主，小肽雖然在相界面上能自由移動和吸附，但卻不能像大分子量的蛋白質一樣在界面上可以展開并適應界面張力，所以其乳化性相對較低[14，15]。

2.4 疏水性與乳化性之間的關系

由圖1、圖2可以看出，6種酶解方式下，隨著水解時間的延長，酶解產物的疏水性指數、疏水性氨基酸質量分數以及乳化性指數的變化規律大致相同，所以，選取其中一種酶切方式——胰蛋白酶水解來研究疏水性以及疏水性氨基酸質量分數與乳化性之間的關系，結果如圖5和圖6所示。

由圖5和圖6可以看出：乳化性指數隨其疏水性指數的降低而升高，這可能是由于經過蛋白酶水解作用的產物會暴露出疏水鍵或疏水基團，疏水性氨基酸的含量逐漸增大，使水解產物具有表面活性劑的功能，表面活性明顯提高，從而有效的降低界面張力；水解度越大，疏水性氨基酸暴露的越多，界面張力越低，越有利于乳化層的形成，其乳化性指數也就越高[16,17]。由于胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的主要酶切位點是疏水性氨基酸的肽鍵，水解產物中疏水性氨基酸含量都較高，能夠很好的維持油水界面處乳化層的穩定性，所以，二者的水解產物乳化性指數也相應較高；其他幾種蛋白酶水解產物的乳化性指數雖略低，但是都與疏水性指數呈現負相關趨勢，這說明，在酶的作用下，水解產物的疏水性氨基酸質量分數越高，其乳化能力越強。

3 結 論

采用具有不同酶切位點的酶對乳清蛋白進行定位酶解，考察了不同酶對乳清蛋白的水解情況以及不同酶切位點對疏水性、乳化性和乳化穩定性的影響。Alcalase蛋白酶與木瓜蛋白酶雙酶作用于對乳清蛋白的水解效果較好；不同蛋白酶作用于乳清蛋白得到的水解產物疏水性不同，6種蛋白水解液的疏水性均隨水解度的增大而降低，但降低的程度各不相同，其中以酶切位點是疏水性氨基酸肽鍵的Alcalase蛋白酶、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的水解產物疏水性指數隨水解度的增大下降的幅度較大。不同酶解條件下的乳清蛋白水解物，在水解之初，隨著水解度的增大其乳化性和乳化穩定性有所提高，但隨著水解度的進一步增大，乳化性和乳化穩定性便隨之降低。在酶的作用下，水解產物的疏水性指數隨疏水性氨基酸質量分數的增大而降低，其乳化能力與疏水性氨基酸質量分數呈正相關。

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Effects of enzymatic hydrolysis on hydrophobicity and emulsifying properties of whey protein isolate

HAN Ren-jiaoa,LIU Chun-hongb，FENG Zhi-biaob
（Northeast Agricultural University a.College of Food Science；b.Department of Chemistry,Harbin 150030,China）

The objective of the present study was to investigate the effects of different proteinases on hydrophobicity and emulsifying capacity of whey protein isolate（WPI）,and the relationship of hydrophobicity and emulsifying capacity was discussed.Results indicated that hydrophobicity could be influenced by different proteinases,and could be decreased with the increase of degree of hydrolysis.The sample treated by Chymotrypsin owned the best hydrophobicity.Another phenomenon was witnessed that emulsifying capacity was improved with the increase of degree of hydrolysis at first,but drops gradually,The sample treated by double-enzyme owned the worst emulsifying capacity.The emulsibe index decreased with the increase of hydrophobic index,the emulsible index and the hydrophobic amino acid content present positive related.

whey protein isolate;enzymatic hydrolysis;degree of hydrolysis;hydrophobicity;emulsifying capacity

TQ936.21+1

A

1001-2230（2011）10-0015-04

2011-06-08

韓仁嬌（1986-），女，碩士研究生，從事農產品加工方面及貯藏方面的研究。

馮志彪