巴氏消毒乳儲存過程中化學與微生物變化

張宏偉，鄭冬梅，孔保華

（東北農業大學 食品學院，哈爾濱 150030）

巴氏消毒乳儲存過程中化學與微生物變化

張宏偉，鄭冬梅，孔保華

（東北農業大學 食品學院，哈爾濱 150030）

通過研究不同儲存溫度的巴氏消毒乳感官品質、生化指標和微生物數量，來確定影響巴氏消毒乳品質的主要因素。結果表明，在5 d的儲存期內，巴氏消毒乳在4℃和8℃儲存條件下感官品質變化趨勢幾乎一樣，在12℃儲存條件下感官品質下降趨勢較4℃和8℃儲存條件下快。巴氏消毒乳中脂肪酶的活力、TBARS值和蛋白水解程度均隨著儲存時間的延長而逐漸升高，SDS-PAGE顯示主要蛋白未見明顯分解，金黃色葡萄球菌未檢出，嗜冷菌的數量逐漸減少，菌落總數呈現對數生長趨勢并在儲存的第4天達到穩定期。巴氏消毒乳中殘存的脂肪酶、蛋白酶和微生物是影響巴氏消毒乳品質的主要因素。

巴氏消毒乳；儲存；品質變化

0 引 言

巴氏消毒乳是一種常見的乳制品，巴氏消毒可殺死乳中有害微生物并最大限度地保存其營養物質[1]。常見的嗜冷菌包括假單胞菌屬、產堿桿菌屬、無色桿菌屬、克雷伯氏菌屬[2]，假單胞菌屬和芽胞桿菌屬產蛋白酶和脂肪酶在乳制品加工之后還殘存活力，并被死亡的菌體釋放到乳制品中[3]，有研究表明原料乳中嗜冷菌產生的胞內蛋白酶與UHT奶膠凝有關[4]，蛋白酶的水解作用還使得乳制品變苦澀，嚴重影響品質[5]。隨著冷藏設備的推廣，嗜冷菌成為影響乳制品品質的主要因素。許曉曦對哈爾濱地區的原料乳進行研究，研究表明原料乳中特征病原菌為金黃色葡萄球菌[6]。本實驗研究不同儲存溫度條件下巴氏消毒乳的感官品質、生化指標和微生物數量，來確定影響巴氏消毒乳品質的主要因素。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

新鮮無抗原料乳，冷卻到4℃，4-硝基苯酚丁酸鹽（SIGMA），D532A標準蛋白分子量蛋白，苯甲基磺酰氟，丙烯酰胺，Tris，其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

DELTA 320 pH計，UT-1800紫外可見分光光度計，LG10-24A高速離心機，DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，Powerpac Basic Power Supply電泳儀，Mini-Protean Tetra Electrophoresis System電泳槽，GIS2020凝膠成像儀。

1.3 方法

1.3.1 原料乳的巴氏消毒

將原料乳63℃，30 min巴氏消毒。每只滅菌的100 mL三角瓶約分裝60 mL巴氏消毒乳。分別放入4，8和12℃的搖床，以80 r/min震蕩培養。

1.3.2巴氏消毒乳的感官評定[7]

由10位感官評定人員組成評定小組，感官評定人員有過乳制品加工和感官評定的經驗，對乳制品無偏見、評定時味覺正常未使用有氣味的化妝品。評價員評定時不能饑餓或過飽，在評定前1 h內不抽煙、不吃東西，僅喝水。待樣品恢復至室溫時對樣品進行感官評定，每只透明塑料杯倒入約30 mL樣品并進行隨機編號。在測定前首先新鮮巴氏消毒乳樣品進行訓練。每次評定由每個評定成員單獨進行，相互不接觸交流，樣品評定之間用清水漱口。

具體的評定方法如下：

（1）色澤。取適量樣品于統一的透明杯中，在柔和的日光或燈光下觀察色澤。呈均勻一致的乳白色或稍帶微黃色為7分；均勻一色，但顯黃褐色為4分；不均勻的黃褐色1分。

（2）組織狀態。輕輕晃動杯子，在柔和的日光或燈光下觀察組織狀態。 呈均勻的流體、無沉淀、無凝塊、無、雜質，無黏稠和濃厚現象，無脂肪上浮現象7分；有少量脂肪上浮現象外基本呈均勻的流體。無沉淀、無凝塊、無雜質、無黏稠和濃厚現象，有微量的絮狀物沉淀或脂肪上浮4分；有黏稠和濃厚現象，有凝塊或分層現象1分。

（3）滋氣味和苦澀味。先聞氣味，再品嘗樣品的滋味。具有乳的香味，無其他異味7分；具有乳的香味，略有酸味或臭味4分；有明顯的酸味、臭味和異味1分。無苦味7分；有可以覺察的苦味4分，有苦味1分。

（4）總體可接受性?？傮w可接受行對該樣品的接受程度。完全接受7分；不能完全接受4分；厭惡1分。

1.3.3 乳中脂肪酶活力的測定

采用4-硝基苯酚的游離釋放法測定[8]。

樣品的制作：0.5 mL樣品與2 ml濃度為0.05 mo/L（pH=7.6）巴比妥—鹽酸緩沖液混勻，37℃條件下水浴15 min，添加50 μL濃度為0.05 mol/L4-硝基苯酚丁酸鹽乙腈溶液，混勻后與37℃條件下水浴10 min，加入0.4ml抑制劑（3體積濃度為0.06 mol/L，pH=7.6 EDTA溶液與1體積的0.06 mol/L的PMSF的二甲基甲酰胺溶液混合）和2 ml乳品澄清劑，混勻，37℃條件下水浴3～5 min。

空白管取乳樣0.5 mL與2 mL巴比妥—鹽酸緩沖液混合，添加抑制劑混合物400 μL，混勻，37℃條件下水浴15 min，加入50 μL 4-硝基苯酚丁酸鹽溶液，其它步驟同樣品。

測定以空白管作為對照樣，將樣品管中的混合物置于420 nm波長下，15 min之內讀取吸光值A。

1.3.4 巴氏消毒乳中脂肪氧化程度的測定

TBARS的測定參照Sinnhuber的方法[9]，并作適當的修改。取1 mL樣品中放入反應管中，再加入3 mL硫代巴比妥酸溶液、17 mL三氯乙酸-鹽酸溶液，混勻后在沸水浴中反應30 min后，冷卻。取5 mL冷卻后的反應液樣品加入等體積的氯仿，3 000 r/min條件下離心10 min后，在532 nm處讀取吸光值。TBARS值以每千克脂質氧化樣品溶液中丙二醛的毫克數表示，其計算公式為

式中：A532為溶液的吸光值；9.48為常數。

1.3.5 巴氏殺菌乳蛋白水解度的測定

使用蛋白水解度（DH）表示：采用鄰苯二甲醛法即OPA試劑法。參照Church[10],和管軍軍[11]的方法改進。準確稱取40 mg的OPA溶解于1 mL的甲醇中,分別加入質量分數20%的SDS 2.5mL，濃度為0.1 mol/L的硼砂25 mL及100 μL β-巰基乙醇,最后用蒸餾水定容到50 mL制成OPA試劑。測定時，取OPA試劑4 mL于試管中，加入200 μL乳樣，混勻后于室溫反應20 min，在340 nm下測其吸光值。用水代替樣品，其他步驟同樣品制作空白。

1.3.6 SDS-PAGE

參照Kong的方法[12]，使用的濃縮膠的質量濃度為120 g/L，分離膠的質量濃度50 g/L，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。

1.3.7 巴氏消毒乳的pH值測定

使用pH計測定不同貯藏溫度和不同貯藏時間下的樣品的pH值。

1.3.8 乳中微生物的測定

（1）嗜冷菌菌數的測定[13]，采用BS ISO 17410-2001方法檢驗嗜冷菌菌落總數。

（2）菌落總數的測定[14]，采用GB/T4789.2-2003方法檢驗菌落總數。

（3）金黃色葡萄球菌菌數的測定[15]，采用GB/T 4789.10-2003方法檢驗金黃色葡萄球菌數。

1.3.9 統計分析

每個實試驗重復3次，結果表示為平均數±SD。數據統計分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 巴氏消毒乳的感官評定結果

乳的色澤在消毒前后感官指標沒有顯著地區別，由于加熱使得乳的香味更加濃厚，使得消毒后乳的滋氣味要好于原料乳，但是差距不是很顯著。在4℃和8℃儲存條件下在第1，2和3天感官指標基本沒有發生顯著地變化，第4天的滋氣味發生顯著的劣變，苦澀味也開始被覺查出來，第五天乳的色澤發生可觀察到的變化，其他各項指標繼續變差，樣品總體可接受性顯著下降（見表1和表2）。

由表3可以看出，12℃儲存條件下在第3天苦澀味可以被明顯的覺查出來，其他指標變化并不顯著，第4天的滋氣味發生顯著的劣變，苦澀味也更加明顯，樣品總體可接受性顯著下降，第五天乳的各項指標均發生顯著的劣變。在可見隨著儲存溫度的升高，乳的感官品質會加速劣變。巴氏消毒乳的總體可接受性也隨著儲存時間的延長而降低，在4℃和8℃儲存條件下下降趨勢幾乎一樣，12℃儲存條件下巴氏消毒乳的感官品質的下降趨勢較4℃和8℃儲存條件的要快。

表14 ℃儲存條件下巴氏消毒乳的感官評定得分

表28 ℃儲存條件下巴氏消毒乳的感官評定得分

表312 ℃儲存條件下巴氏消毒乳的感官評定得分

2.2 巴氏消毒乳的脂肪酶活力變化

圖1為巴氏消毒乳中脂肪酶的活力變化結果。圖1中，同一列字母中，在同一溫度的不同組之間，相同則表示差異不顯著，不同則表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

由圖1可以看出，原料乳中脂肪酶的活力在巴氏消毒后明顯下降，巴氏消毒乳中脂肪酶的活力隨著儲存時間的延長逐漸升高，在8℃和12℃儲存條件下，在第3天時酶的活力明顯上升，在4℃儲存條件下，在第3天時酶的活才明顯上升。在5 d儲存過程中脂肪酶活力隨著儲存時間的延長和儲存溫度的升高而升高。Matta和Punj[3]的研究表明假單胞菌屬和芽胞桿菌屬的蛋白酶和脂肪酶生產乳和乳粉的加熱工序后還有活力，當菌體被殺死后釋放到液體奶中。脂肪酶的活力的不斷增強，使得乳脂肪被分解的可能性越大，被分解的數量越多，使得乳中短鏈脂肪酸增多，乳的風味變差。

2.3 乳中脂肪氧化程度的測定

由于乳品中約含有質量分數為3.5%的脂肪，因此TBARS值可作為乳品氧化程度的一個重要指標。圖2為巴氏消毒乳中脂肪氧化程度的變化。由圖2可以看出，乳的TBARS值在巴氏消毒后略有上升，可能是由于加熱造成部分脂肪和蛋白氧化造成。巴氏消毒乳TBARS值隨著儲存時間的延長和儲存溫度的升高呈現逐漸升高的趨勢。8℃和12℃儲存條件的樣品在第2天時TBARS值明顯上升，在4℃儲存條件下在第4天時TBARS值才明顯上升。在5 d儲存過程中TBARS值隨著儲存時間的延長和儲存溫度的升高而升高，在TBARS值顯著升高以后，TBARS值變化較為穩定，可知，在5 d的儲存期內4～12℃儲存條件下，乳脂肪雖然可以被氧化，但是只是一定程度上的氧化。

2.4 巴氏殺菌乳中蛋白水解程度

2.4.1 乳蛋白水解度的變化

圖3為巴氏消毒乳中蛋白水解度的變化。由圖3可以看出，乳中蛋白水解度在巴氏消毒后略有上升，可能是由于加熱造成部分蛋白水解造成乳中蛋白水解度在巴氏消毒后略有上升，巴氏消毒乳中蛋白水解度隨著儲存時間的延長逐漸升高，在1～2 d的時候上升最明顯。

乳中蛋白水解度在巴氏消毒后略有上升，可能是由于加熱造成部分蛋白水解造成乳中蛋白水解度在巴氏消毒后略有上升，巴氏消毒乳中蛋白水解度隨著儲存時間的延長逐漸升高，在1～2 d的時候上升最明顯。

一般來說，蛋白分解可能有兩種途徑：一個是水解，包括酶或酸的水解，一個是劇烈的處理使得蛋白的主鏈的基團損壞。Meltretter等人[16]的研究認為，原料乳熱處理后由酪蛋白分解產生5種新的小肽，在4℃條件下儲存時，這些小肽沒有變化，而在室溫儲存條件下，由于蛋白酶的酶解作用使得一個小肽明顯增多。

感官評定結果表明，在4℃和8℃在儲存的巴氏消毒乳在第4天苦澀味也開始可以被覺查出來，12℃儲存條件下的巴氏消毒乳在第3天苦澀味開始可以被明顯的覺查出來，這種可以覺察的苦味。牛乳中的大多數蛋白酶不易被牛乳加工過程中的熱處理破壞，而且處理后仍然具有活性[17]，苦味可能是殘存的蛋白酶對乳蛋白的水解產生了一些呈苦味的肽，在溫度較高的條件下蛋白酶對蛋白的分解能力較強，使得12℃儲存條件下的巴氏消毒乳在第3天就有苦味。

2.4.2 SDS-PAGE

圖4為巴氏消毒乳的SDS-PAGE電泳結果。圖4（a）（b）（c） 表示4，8，12℃儲存的巴氏消毒乳的SDSPAGE電泳結果。圖4中，Ⅰ為標準分子量蛋白，Ⅱ為原料乳，Ⅲ為巴氏消毒乳，Ⅳ為巴氏消毒乳儲存2 d，Ⅴ為巴氏消毒乳儲存3 d，Ⅵ為巴氏消毒乳儲存4 d，Ⅶ為巴氏消毒乳儲存5 d。α3-酪蛋白分子量為23.5 ku，β-酪蛋白分子量為24 ku，κ-酪蛋白分子量為19 ku；α-乳白蛋白分子量為14 ku，β-乳球蛋白分子量為18 ku；血清白蛋白分子量為66 ku[18]。

在4～12℃儲存溫度條件下，各個主要蛋白只是輕微的分解，或者有從電泳中看不出的分解?？梢缘贸鼋Y論：巴氏消毒乳在4～12℃儲存溫度條件下儲存5 d未見明顯的主要蛋白分解。大多數嗜冷菌產生的蛋白水解酶優先攻擊酪蛋白然后才攻擊乳清蛋白，而且β-酪蛋白和κ-酪蛋白比αs-酪蛋白更為敏感[19]，但是在電泳圖中沒有發現各個蛋白的顯著分解，但是乳蛋白的水解度卻上升并在儲存的第4天巴氏消毒乳就可以產生可以覺察的苦味，可以推斷蛋白酶水解蛋白的程度較小，因此在SDS-PAGE沒有明顯的體現。

2.4.3 巴氏消毒乳的pH值變化

圖5為巴氏消毒乳pH值變化。由圖5可以看出，乳的pH值在巴氏消毒后略有上升，可能是由于加熱造成部分蛋白水解分離出NH2-造成乳的pH值上升。在4～12℃儲存條件下在巴氏消毒乳pH值隨著儲存時間的延長呈現逐漸升高的趨勢，在較高的儲存溫度條件下儲存的巴氏消毒乳pH值升高的較慢，而且最終的pH值較低溫儲存的低。這是由于原料乳的低溫儲存使得嗜冷菌成為優勢菌，雖然大多數嗜冷菌可以被巴氏消毒殺滅，但是當菌體被殺死后其產生的耐熱蛋白酶被釋放到液體奶中[3]，仍然使得蛋白被分解，產生NH2-造成乳的pH值略有上升，而且在低溫條件下，乳酸菌的生長受到抑制，不易產酸，但是在稍高的儲存溫度下，乳酸菌的生長代謝使得乳的pH值降低。

2.5 巴氏消毒乳中微生物的變化

2.5.1 嗜冷菌菌數的變化

圖6和圖7分別為不同儲存溫度條件下嗜冷菌菌數的變化和菌落總數的變化。嗜冷菌的數量在巴氏消毒后立即減少3個數量級，這是由于嗜冷菌大多不耐熱，可以被巴氏消毒殺滅。在后續的培養中，嗜冷菌的數量逐漸減少，直至檢測不出，可見巴氏消毒對嗜冷菌的殺滅效果很好。

2.5.2 菌落總數的變化

菌落總數在巴氏消毒后立即減少接近3個數量級，這是由于不耐熱的微生物被殺滅的原因。在后續的培養中，菌落總數呈現對數生長的狀態，可見巴氏消毒對乳中的耐熱微生物和芽孢殺滅效果很差，一些耐熱的微生物在沒有競爭的條件下，在較低的溫度下也可以緩慢的生長。由于乳的pH值略有上升，可以推斷產酸的乳酸菌在4～12℃儲存的巴氏消毒乳中被抑制。

2.5.3 金黃色葡萄球菌菌數的變化

原料乳中的金黃色葡萄球菌菌數為4 300 mL-1，經過巴氏消毒后，在巴氏消毒乳中未檢出金黃色葡萄球菌，并且在試驗儲存期間也未檢出金黃色葡萄球菌，這是由于金黃色葡萄球菌不耐熱而且無芽孢，能夠被巴氏消毒殺滅。金黃色葡萄球菌是乳中重要的致病菌，據美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的細菌性食物中毒居第一位，占整個細菌性食物中毒33%，加拿大則高達45%，由此而造成的經濟損失也相當慘重[20]。試驗證明巴氏消毒對金黃色葡萄球菌殺滅效果很好，只要消毒后灌裝過程沒有污染金黃色葡萄球菌，就可以保證巴氏消毒乳的安全。

冷藏儲存的牛乳中選擇性生長嗜冷微生物（Psychrotrophic microorganisms）。在隨后的原料乳巴氏消毒或其他處理過程中殺滅或去除這些微生物，萌發的芽孢或再污染仍然會導致品質的劣變。金黃色葡萄球菌產生的腸毒素耐熱，但是在冷藏條件下金黃色葡萄球菌很難產毒。因此，加工之前嗜冷菌產生的耐熱的細胞外的蛋白水解酶和脂肪酶是造成乳制品貯存期間酸敗的主要因素，當原料乳中含有5.5 mL-1（對數值）的嗜冷菌時，制成的巴氏消毒乳就容易產生苦味[21]，這就使得微生物代謝產的耐熱酶成為影響乳制品品質的重要因素。

3 結 論

用來制作巴氏消毒乳的原料乳的質量對巴氏消毒乳的品質和儲存品質有重要的影響，原料乳中的嗜冷菌和金黃色葡萄球菌可以被殺滅，但是嗜冷菌產脂肪酶和蛋白酶對熱穩定，會對乳的品質有很大的影響，由于巴氏消毒對乳中的耐熱微生物和芽孢殺滅效果很差，因此推薦使用菌數較低的原料乳來加工巴氏消毒乳。巴氏消毒乳在4～8℃儲存時，儲存3 d，感官未見異常且各項理化指標正常，在12℃儲存時，在第3天品質明顯下降，建議巴氏消毒乳儲存在8℃以下，在4 d之內飲用。

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Chemical and microbiological changes of pasteurized milk during storage

ZHANG Hong-wei,ZHENG Dong-mei,KONG Bao-hua
（Food Department of Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China）

The sensory quality,biochemical targets and the amount of microorganism were studied in order to confirm the main factors affect ing pasteurized milk.The result indicated that the changing trend of the sensory quality was almost the same under the storage condition at 4℃and 8℃during the 5 day storage period,while the sensory quality decreased fast under the storage condition at 12℃compared with the former（4℃and 8℃）.The activity of lipase,TBARS value and the degree of proteolysis were increasing with the prolonging of the storage time in the pasteurized milk.SDS-PAGE showed there was no conspicuous decomposition in the main proteins.Staphylococcus aureus was not detected and Psychrophiles reduced.The total number of bacterial colony presented a logarithmic tread,and then came up to the stationary phase at the forth day during the storage period.So the remaining lipase,protease and microorganism residues were major factors affecting the quality of pasteurized milk.

Pasteurized Milk;Storage;Quality Change

TS252.2+6

A

1001-2230（2011）10-0027-05

2011-03-16

張宏偉（1982-），男，碩士，研究方向為畜產品加工。

鄭冬梅