血啉甲醚對單增李斯特菌的光動力滅活作用及機理＊

林少玲,唐書澤,唐姝姝,吳希陽,陳振強

光動力技術是指生物組織中的光敏物質受到相應波長光照后,吸收光子能量,由基態躍遷到激發態,并迅速退激釋放能量而返回基態的過程。該過程能夠生成大量活性氧,活性氧與多種生物大分子相互作用,從而損傷細胞結構或影響細胞功能[1-2]。在醫學上,利用光動力反應進行疾病診斷和治療的技術稱之為光動力療法 (photodynamic therapy,PDT),目前主要用于惡性腫瘤和皮膚癌的治療[3],在血液制品消毒等方面的作用也得到了廣泛認同,其安全性也得到了較為詳盡的論證[4-5]。

光動力滅菌技術 (anti-microbial photodynamic technology,APDT)是在光動力技術的基礎上,利用光敏劑對細菌的優先聚集特性,在適當波長的光激發下,使光敏劑吸收能量后產生單線態氧、自由基等活性氧物質進而通過氧化作用殺傷微生物,而不傷害周圍組織和細胞的一項新技術[6]?？股厥悄壳耙种苹驓绮≡⑸锏闹饕侄?但近年來隨著抗生素濫用導致了諸如“超級細菌”爆發等事件的不斷出現,使人們開始尋找抗生素之外有效且安全的抑菌或殺菌方法[7]。APDT已被證實具有顯著的殺傷耐藥菌的作用[8],本課題組前期研究已證實其對曲霉孢子[9]、金黃色葡萄球菌[10]、蠟樣芽胞桿菌和大腸桿菌[11]具有很好的光動力滅活作用。

單核細胞增多性李斯特菌 (L isterisa m onocytogenes),簡稱單增李斯特菌,是近年來受到特別關注的一種食源性致病菌。在加拿大、美國和歐洲,肉類食品單增李斯特菌食物中毒案例時有報道,感染后發病致死率高達 25%以上[12]。隨著我國肉類消費大幅增加,尤其是對冷鮮肉食品的消費,呈迅速上升趨勢,肉類食品單增李斯特菌污染導致的潛在食物中毒將更加受到關注。本實驗選用單增李斯特菌為實驗菌株,研究血啉甲醚 (hematoporyrin monomethyl ether,HMME)作為光敏劑對單增李斯特菌的 APDT滅活效果,并利用聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)和聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction,PCR)技術分析 HMME對單增李斯特菌菌體蛋白和基因組 DNA的光動力影響,探討光動力滅菌技術的作用機理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

單增李斯特菌,廣州市疾病預防控制中心。

1.1.2 培養基

細菌計數培養基和胰蛋白胨大豆肉湯培養基(tryptone soy broth,TSB),青島海博生物技術有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

血啉甲醚 (10 mg/mL,批號 980225),上海第二軍醫大學五二三藥物研究室;U21901雙光束紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;75 W溴鎢燈 (光源光功密度為 200 mW/cm2),北京卓立漢光儀器有限公司;TaqMix和細菌基因組DNA快速提取試劑盒,廣州東盛生物科技有限公司。

1.3 引物合成

依據文獻[13]針對單增李斯特菌hlyA全基因序列,利用 primer 5.0設計引物,委托上海捷瑞生物工程有限公司合成,其序列如下:上游引物 5’-TGC AAG TCC TAA GAC GCC A-3′下游引物 5’-CAC TGC ATC TCC GTG GTA TAC TAA-3′

1.4 單增李斯特菌的光動力滅活試驗

1.4.1 菌株培養及前處理

將活化的單增李斯特菌接種于 TSB培養液中,37℃振蕩培養至對數期,離心收集菌體 (4 000 r/min,10 min),棄上清液,重新懸浮菌體于 0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液 (PBS)中,使其OD600=0.05(相當于 107CFU/mL左右)。

1.4.2 HMME濃度試驗

在 96孔細胞培養板中 (任取 1孔)加入已處理好的 200μL菌懸液,并加入不同濃度 HMME,使其終濃度分別為 1,5,10,25和 50μg/mL,37℃避光孵育 30 min,放在距離溴鎢燈光源 20 cm處照射 30 min后進行平板計數 (L+S+)。同時設置不光照和 或不加 HMME組作為對照 (L-S-;L+S-;L-S+)。

1.4.3 光照時間試驗

按照 1.4.1方法處理單增李斯特菌后,在 96孔板中 (任取 1孔)各加入 200μL菌懸液并加入HMME,使其終濃度為 25μg/mL,37℃避光孵育 30 min后放在距離溴鎢燈光源 20 cm處照射 5,10,20和 30 min后進行平板計數 (L+S+)。同時設置不光照和 或不加 HMME組作為對照 (L-S-;L+S-;L-S+)。

1.4.4 細菌菌落平板計數

1.4.2 和 1.4.3中不同處理方式所得的菌懸液均以 1∶10梯度稀釋后涂板于細菌計數培養基平皿中,于 37℃生化培養箱中恒溫培養,24 h后取出進行菌落計數。實驗重復 3次,取平均值。

1.5 單增李斯特菌菌體蛋白降解和基因組 DNA損傷試驗

1.5.1 菌株培養及前處理

按 1.4.1的方法培養單增李斯特菌,離心收集菌體 (4 000 r/min,10 min),棄上清液,重新懸浮菌體于PBS,使其OD600=0.05,在 96孔板中 (任取 4孔 ),每孔加入 200μL菌懸液并加入 HMME,使其終濃度為25μg/mL,37℃避光孵育 30 min后,放在距離溴鎢燈光源 20 cm處照射 30 min(L+S+)。同時設置不光照和 或不加 HMME組作為對照 (L-S-;L+S-;L-S+)。

1.5.2 SDS-PAGE分析菌體蛋白降解試驗

1.5.1 中 4組實驗所得的各 800μL菌懸液置于EP管中,離心棄上清液后 (10 000 r/min,2 min)。加入 20μL無菌去離子水重懸菌體,5μL 4×SDSPAGE上樣緩沖液,95℃加熱 5 min后進行 SDSPAGE電泳。

1.5.3 PCR分析基因組DNA斷裂試驗

1.5.3.1 單增李斯特菌基因組 DNA的提取

將 1.5.1實驗所得的 4個實驗菌株進行基因組DNA的提取,單增李斯特菌基因組 DNA抽提按照試劑盒說明書進行,抽提所得基因組 DNA進行瓊脂糖凝膠電泳并作為 PCR檢測 hlyA基因的模板。

1.5.3.2 單增李斯特菌 hlyA基因片段 PCR擴增

使用hlyA基因的上下游引物檢測上述 4組單增李斯特菌基因組 DNA的斷裂情況,PCR反應體系如下:

單增李斯特菌基因組 DNA模板 1μL;2×PCRMix 10μL;

上游引物 1μL;下游引物 1μL;ddH2O 7μL;PCR反應條件:95℃預變性 5 min;95℃變性 30 s,56℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,30個循環;最后 72℃延伸 5 min,反應結束,PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 統計分析

結果以均數 ±標準差表示,用 GraphPad Prism 5所帶的統計軟件進行統計學處理。差異顯著性采用t檢驗,P＜0.05為顯著差異。

2 結果與討論

2.1 HMM E濃度對單增李斯特菌光動力滅活作用的影響

HMME在 0～50μg/mL內對單增李斯特菌的光動力滅活作用見圖1和圖2。從圖1、圖2中可以看出,隨著光敏劑 HMME濃度的增加,對單增李斯特菌的光動力滅活作用逐漸增強。當 HMME濃度低至 1 μg/mL的情況下,光照 30 min即可使約 90%的單增李斯特菌滅活。當 HMME濃度達到 50μg/mL時,幾乎可完全使單增李斯特菌滅活。而光照對照組及光敏劑對照組,均未顯示出明顯的殺傷作用。[0]表明一定濃度的 HMME在光照情況下對單增李斯特菌有較好的殺傷作用。

圖1 不同濃度 HMME對單增李斯特菌菌落數 (CFU)的影響

圖2 不同濃度 HMME對單增李斯特菌失活率的影響

2.2 光照時間對單增李斯特菌光動力滅活作用的影響

圖3 和圖4顯示了 HMME濃度在 25μg/mL時,光照時間對單增李斯特菌的光動力滅活作用的影響。光照 10 min以上,均能使菌落總數降低 2個數量級以上,即 99%以上的單增李斯特菌被滅活;當光照時間達到 30 min時,幾乎可以完全殺傷單增李斯特菌,滅活率達到 99.999 9%。表明 HMME在一定濃度下,光動力殺菌技術對單增李斯特菌的光動力殺傷作用隨著光照時間的延長而加強。

圖3 不同光照時間的 HMME對單增李斯特菌菌落數的影響

2.3 HMM E-APDT對單增李斯特菌細菌全蛋白降解效果的影響

圖4 不同光照時間的 HMME對單增李斯特菌失活率的關系

HMME-APDT對單增李斯特菌細菌全蛋白的降解作用見圖5,其中條帶M是蛋白質分子量標準 (6.5～175 ku),條帶 1是光敏劑進行光照的不帶菌空白條帶,條帶 2是不加光敏劑直接進行光照的光照對照組,條帶 3是不加光敏劑并且不光照的完全對照組,條帶 4是加光敏劑并且進行光照的實驗組,條帶 5則是加光敏劑不光照的光敏劑對照組。從圖中可以明顯看出,單增李斯特菌在光敏劑 HMME(25μg/mL),光照 30 min的情況下,其菌體大部分蛋白被降解,只在 20 ku處有一降解不完全的條帶。而光照對照組及光敏劑對照組與完全對照組相比較,蛋白條帶無明顯變化。

圖5 HMME-APDT處理后細菌全蛋白 SDS-PSGE圖譜

2.4 HMM E-APDT對單增李斯特菌 DNA全基因組損傷效果影響

HMME-APDT對單增李斯特菌基因組 DNA的影響見圖6,其中條帶 1是不加光敏劑直接進行光照的光照對照組,條帶 2是不加光敏劑并且不光照的完全對照組,條帶 3是加光敏劑并且進行光照的實驗組,條帶 4則是加光敏劑不光照的光敏劑對照組。與完全對照組 (L-S-)、光照對照組 (L+S-)和光敏劑對照組 (L-S+)相對比,經過 25μg/mL的光敏劑HMME和 30 min的光照處理的實驗組單增李斯特菌基因組DNA斷裂非常明顯,幾乎看不到 DNA片段。為了更準確比較實驗組與試驗對照組的基因組DNA的斷裂程度,同時進行更為靈敏的 PCR鑒定。

以單增李斯特菌的特異性基因hlyA基因設計引物,進行 PCR,結果見圖7,其中條帶 M是 DNA分子量標準 (DL 5000),條帶 1是不加光敏劑直接進行光照的光照對照組,條帶 2是不加光敏劑并且不光照的完全對照組,條帶 3是加光敏劑并且進行光照的實驗組,條帶 4則是加光敏劑不光照的光敏劑對照組。通過光敏劑 HMME(25μg/mL)和 30 min光照處理的實驗組僅有微弱的 PCR產物生成,而其余各試驗對照組均獲得一明亮的特異性 PCR產物條帶,且條帶大小與所設計的hlyA基因片段 112 bp大小吻合。表明單增李斯特菌在一定濃度光敏劑HMME光照30 min的情況下確實能夠引起基因組 DNA斷裂,且損傷程度較大。

圖6 瓊脂糖凝膠電泳分析 HMME對單增細胞李斯特菌光動力處理的全基因組圖譜

本研究發現光功密度 200 mW/cm2的溴鎢燈光照 30 min下,濃度為 25μg/mL的 HMME能殺滅99.999%的單增李斯特菌,光照對照組或光敏劑對照組則未觀察到類似殺滅作用。

SDS-PAGE分析發現,HMME-APDT對于活體單增李斯特菌能夠有效降解其絕大部分蛋白質,這與前人的研究結果基本一致。Bliss[14]研究報道,光敏劑對細胞的光動力失活效應中主要涉及脂質過氧化和蛋白質變性失活。Tubby[15]等人通過細菌體外試驗發現光敏劑能夠在光照情況下誘發蛋白質降解。本研究結果進一步表明,光動力技術的滅菌效果,可能是通過氧化降解等途徑[16]引起細菌內蛋白降解,從而導致單增李斯特菌失活。

圖7 單增李斯特菌 hlyA基因 PCR擴增結果

Menezes[17]在研究光動力滅活大腸桿菌的實驗中發現,APDT能夠造成其基因組 DNA損傷。本研究中,HMME-APDT被發現同樣能夠有效降解單增李斯特菌的基因組 DNA。結果表明,HMME-APDT的滅菌作用不僅來自于對細菌蛋白質的變性,還來自于細菌基因組DNA斷裂破壞作用。

HMME作為一種新型光敏劑,屬于天然產物,因來源廣泛,安全性較高,可以作為一種很有前景的滅菌技術應用于肉類食品工業。

3 結論

濃度為 25μg/mL的 HMME在光功密度為 200 mW/cm2的可見光光照 30 min下,對單增李斯特菌的光動力滅活效果高達 99.999 9%,并能導致其蛋白質和基因組降解,表明光動力技術對單增李斯特菌具有極強的滅活作用,蛋白質降解和基因組 DNA受損可能是 HMME-APDT有效滅活單增李斯特菌的作用機理。

[1] Macdonald IJ,Dougherty T J.Basic principlesof photodynamic therapy[J].Journal of Porphyrins and Phthalocyanines,2001,5:105-129.

[2] DolmansD E J G J,Fukumura D,Jain R K.Photodynamic therapy for cancer[J].Nature,2003,3:380-387.

[3] Ochsner M.Photodynamic therapy:the clinical perspective:review on applications for control of diverse tumors and non-tumorous disease[J].Arzneimittel-Forschung-Drug Research,1997,47:1 185-1 194.

[4] Luksiene Z,Peciulyte D,Jurkoniene S,et al.Inactivation of possible fungal food contaminants by photosensitization[J].Food Technology and Biotechnology,2005,43(4):335-341.

[5] Malik Z,Ladan H,Nitzan Y.Photodynamic inactivation of gram negative bacteria:problems and possible solutions[J].Photochemistry and Photobiology,1990,5(B):811-816.

[6] Maisch T.Anti-microbial photodynamic therapy:useful in the future[J].Lasers inMedical Science,2007,22:83-91.

[7] WainwrightM,Phoenix D,Marland J,et al.A Study of photobactericidal activity in the Phenothiazinium Series[J].Fems I mmunology and MedicalMicrobiology,1997,19:75-80.

[8] WainwrightaM,Phoenixa D A,GaskellaM.Photobactericidal activity of methylene blue derivatives against vancomycin resistantEnterococcusspp.[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy,1999,44:823-825.

[9] 李穎,唐書澤,任雅清,等 .光敏化作用對曲霉孢子失活的影響[J].食品與發酵工業,2008,34(8):22-24.

[10] 任雅清,唐書澤,金花,等 .光動力對金黃色葡萄球菌的殺傷作用及其 AFM觀察[J].食品與發酵工業,2008,34(8):56-59.

[11] 任雅清,唐書澤,吳希陽,等 .光動力對細菌的殺傷作用研究[J].中國調味品,2008(6):37-40.

[12] Chen Y,ZhangW,Knabel S J.Multi-virulence-locus sequence typing identifies single mucleotide polymorphisms which differentiate epidemic clones and outbreak strains ofListeria m onocytogenes[J].Journalof ClinicalMicrobiology,2007,45(3):835-846.

[13] Rudi K,Nogva H K,Naterstad K.SubtypingListeria m onocytogenesthrough the combined analyses of genotype and expression of thehlyA virulence determinant[J].Journal ofAppliedMicrobiology,2003,94,720–732.

[14] Bliss J M,Bigelow C E,Foster T H,et al.Susceptibility ofCandidaspecies to photodynamic effects of Photofrin[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2004,48:2000-2006.

[15] Tubby S,W ilson M,Nair S P.Inactivation of staphylococcal virulence factors using a light-activated antimicrobial agent[J].BMCMicrobiology,2009,9:211.

[16] Hamblin M R,Hasan T.Photodynamic therapy:a new antimicrobial approach to infectious disease[J].Photochemical and Photobiological Sciences,2004,3(5):436-450.

[17] Menezes S,CapellaM A,CaldasL R.Photodynamic action ofmethylene blue:repair and mutation inEscherichia coli[J].Journal of Photochemistry and Photobiology BBiology,1990,5:505-517.