（S/R）-2-（5-氟尿嘧啶-1-基乙?；┌被?3-苯基丙酸甲酯的合成及抗腫瘤活性*

葉彩萍，黃祖勝，姚 婷，王元超

（溫州大學 化學與材料工程學院，浙江 溫州 325035）

50多年來，5-氟尿嘧啶（5-FU）始終作為首選抗代謝藥用于治療胃癌、腸癌、肝癌等，乳腺癌、宮頸癌等[1-3]。但由于其代謝顯著，脂溶性小、口服吸收困難、毒副作用較大，在殺死癌細胞的同時也嚴重損傷正常細胞[4,5]。為降低其毒副作用，多年來國內外對5-FU進行了大量的化學修飾工作，并取得了一定的成果，如引入氨基酸或短肽[6,7]、葡萄糖[8]、卟啉[9]等，并對其藥理、毒理、代謝等進行了大量的研究。

鑒于正常細胞與腫瘤細胞對氨基酸的需求量不同，如腫瘤細胞對苯丙氨酸的需求量是正常細胞的2～3倍[10]，以氨基酸作為氮介的載體用來提高5-FU對腫瘤細胞選擇性的研究工作已有一些報道[11,12]，肽類化合物對細胞及核酸具有很好的親和性，將肽鏈骨架引到藥物如抗癌藥分子中，將有利于藥物到達細胞組織內，使之更有效地發揮作用。另外，已有研究表明，人體的一些疾病與體內D-氨基酸的含量水平有關，因此，D-氨基酸對研究某些疾病和衰老機制十分重要[13，14]。在多肽類藥物中，D-氨基酸代替L-氨基酸會大大延長肽類藥物的半衰期并降低副作用。因此，本文在藥物分子5-氟尿嘧啶中分別引入L、D-苯丙氨酸甲酯，考察該對映體在抗腫瘤中的表現。

1 實驗部分

1.1 主要原料

5-氟尿嘧啶、1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）、1- 羥基苯并三氮唑（HOBt），L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽、D-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽、三乙胺（TEA）等均為化學純；N,N'-二甲基甲酰胺（DMF）、無水乙醇、NaOH等試劑為分析純。

1.2 主要儀器

BRUKER AVANCE-300 MHz型核磁共振儀；BRUKER EQUINOX 55型紅外光譜儀；X-6顯微熔點測定儀（溫度未校正）；DECAX-30000 LCQ DecaXP Plus型液相色譜-質譜聯用儀；AUTOPOL IV全自動旋光儀。

1.3 合成過程

目標化合物的合成路線見圖1。

圖1 目標化合物的合成路線Fig.1 Synthetic route of title compounds

根據文獻[7]合成中間體5-氟尿嘧啶-1-基乙酸（I）。

在250mL三口燒瓶中加入2.70g（20mmol）HOBt和3.76g（20mmol）5-氟尿嘧啶-1-基乙酸，用40mL DMF 溶解，分別加入含有 4.32g（20mmol）L、D- 苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽及3.83g（20mmol）EDCI的DMF溶液60mL和3.0mL TEA，室溫下反應，薄層色譜（TLC）跟蹤檢測。反應結束后過濾，減壓蒸去溶劑DMF，石油醚/乙酸乙酯=3∶1～1∶2梯度柱層析分離，旋蒸蒸去溶劑，分別得到白色固體IIa和IIb，收率分別為77%和72%。

2 結果與討論

2.1 反應條件的確定

2.1.1 溶劑的選擇 將中間體I分別溶于二氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃、丙酮、乙醇、1,4-二氧六環、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、吡啶和水中。發現I除在DMF中完全溶解外，在其它溶劑中都不溶或部分溶解。為此選擇DMF作為溶劑。

2.1.2 縮合劑EDCI的用量 在縮合劑EDCI、輔助試劑HOBt及DMF中，只有縮合劑EDCI用量對產物收率有著顯著的影響。當改變EDCI與中間體I的摩爾比時，產物的收率變化明顯。當EDCI∶I摩爾比1.3∶1時，收率基本穩定?？紤]到EDCI的成本因素，選擇其用量為I的1.3倍。

2.2 化合物的結構表征

（S）-2-（5-氟尿嘧啶-1-基乙?；┌被?3-苯基丙酸甲酯，（S）-methyl2-（5-fluorouracil-1-yl-aceto）amino-3-phenylpropanoate（IIa）,白色固體：Yield 77%,m.p.152～153℃,NMR（300MHz,DMSO-d6,TMS）δ 11.82（d,1H,FCCNH,4JFH=4.6Hz）,8.72 （d,1H,NH,J=7.5Hz）,7.93（d,1H,FC=CH,3JFH=6.6Hz）,7.31-7.19 （m,5H,Ar-H）,4.48（dd,1H,NCH,J=7.5,6.0Hz）,4.30（d,2H,NCH2,J=16.8Hz）,3.59 （s,3H,OCH3）,3.05-2.88（m,2H,CCH2）;13CNMR（75MHz,DMSO-d6,TMS）δ 171.7,166.9,157.6（d,2JFC=25.7 Hz）,149.7,139.3（d,1JFC=228.3Hz），137.0，131.1（d，2JFC=33.8Hz）,129.3，128.4，126.8，53.9，52.0，49.4，36.9;IR（KBr,cm-1）ν:3307，3072，1709，1669，1551，1447，1381，1234，698；ESI-MSm/z:348[M-H]-。

（R）-2-（5-氟尿嘧啶-1-基乙?；┌被?3-苯基丙酸甲酯，（R）-methyl2-（5-fluorouracil-1-yl-aceto）amino-3-phenylpropanoate（IIb）,白色固體：Yield 72%,m.p.152～153℃,NMR （300MHz,DMSO-d6,TMS）δ 11.84（s,1H,FCCNH）,8.73（d,1H,NH,J=7.5 Hz）,7.94（d,1H,FC=CH,3JFH=6.9 Hz）,7.32-7.20（m,5H,Ar-H）,4.48（dd,1H,NCH,J=7.8,5.7Hz）,4.30（d,2H,NCH2,J=16.5 Hz）,3.59 （s,3H,OCH3）,3.06-2.89 （m,2H,CCH2）;13C NMR （75MHz,DMSO-d6,TMS）δ 171.7,166.9,157.6 （d,2JFC=25.7 Hz）,149.7,139.3（d,1JFC=228.3 Hz）,137.0,131.1 （d,2JFC=33.8 Hz）,129.3,128.4,126.8,54.0,52.0,49.4,36.9;IR（KBr,cm-1）ν:IR （KBr,cm-1）ν:3424,3313,3072,1707,1665,1548,1450,1382,1346,1242,1045,794.ESI-MSm/z:348[M-H]-。

2.3 化合物的體外抗腫瘤活性

我們委托溫州醫學院對化合物IIa和IIb就結腸癌細胞株SW-480、宮頸癌細胞株Hela采用MTT還原法[15]進行了體外抗腫瘤活性測試另外，委托國家新藥篩選中心對化合物就白血病細胞株HL-60和肝癌細胞株BEL-7402分別用MTT還原法和磺酰羅丹明B（Sulforhodamine B,SRB）蛋白染色法[16]進行了體外抗腫瘤活性測試，測試結果見表1。

表1 10-5mol·L-1濃度下對不同腫瘤細胞的抑制率Tab.1 Inhibition ration to different cancer cell under 10-5mol·L-1

從表1中可以看出，化合物IIa、IIb對4種腫瘤的抑制作用幾乎是同步的，但對SW-480和Hela腫瘤細胞的抑制作用明顯高于對HL-60和BEL-7402的抑制作用，說明IIa、IIb對HL-60和BEL-7402不如對SW-480及Hela敏感，也說明其抗腫瘤活性具有一定的選擇性。此外，我們發現R型化合物IIb對腫瘤的抑制活性都比S型化合物IIa高，說明化合物的構型對抗腫瘤起到一定作用。

3 結論

以EDCI為縮合劑，HOBt為輔助試劑，將中間體5-氟尿嘧啶-1-基乙酸與分別與L和D型苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽進行縮合反應，分別得到S和R型的2-（5-氟尿嘧啶-1-基乙?；┌被?3-苯基丙酸甲酯的對映體。反應條件溫和，操作簡便，收率較高。體外抗腫瘤活性測試結果，發現兩對對映體對SW-480、Hela、HL-60 和 BEL-7402 都具有一定的體外抑制作用，其中IIa和IIb對SW-480、Hela的抑制作用更好，說明化合物對腫瘤的抑制作用具有一定的選擇性；另外，從R型化合物對腫瘤的抑制率高于S型的現象，說明了化合物的絕對構型對抗腫瘤具有一定的作用。

［1］Smith N F,FiggW D,Sparreboom A.Recent Advances in Pharmacogenetic Approaches to Anticancer Drug Development［J］.Drug Development Research,2004,62:233-253.

［2］Parker W B,Cheng Y C.Metabolism and mechanism of action of 5-fluorouracil［J］.Pharmacol Therap,1990,48:381-395.

［3］Diasio R B,Johnson MR.The role of pharmacogenetics and pharmacogenomics in cancer chemotherapywith 5-fluorouracil［J］.Pharmacology,2000,61（3）:199-203.

［4］Peter J.Dandliker,R.Erik Holmlin,Jacqueline K.Barton.Oxidative Thymine Dimer Repair in the DNAHelix［J］.Sci.,1997,275（5305）:1465-1468.

［5］Prasun K.C.,Philip L.C.,Michael J.W.,et al.Plasmin-Activated Prodrugs for Cancer Chemotherapy.1.Synthesis and Biological Activity of Peptidylacivicin and Peptidylphenylenediamine Mustard［J］.J.Med.Chem.,1983,26（5）:633-638.

［6］Nichifor M,Schacht E H.Synthesis ofpeptide derivatives of5-fluorouracil［J］.Tetrahedron,1994,50（12）:3747-3760.

［7］劉學軍,陳茹玉,楊嬡嬡.5-氟尿嘧啶-1-基磷三肽化合物的合成及抗癌活性［J］.高等學?；瘜W學報,2002,23（7）:1299-l303.

［8］羅宣干,卓仁禧,李滿慶.5-氟尿嘧啶的D-氨基葡萄糖衍生物的合成及其抗腫瘤活性的研究［J］.高等學?；瘜W學報,1996,17（9）:1416-1420.

［9］劉彥欽,張慧娟,韓士田.5-氟尿嘧啶-卟啉化合物的合成及抗癌活性［J］.有機化學,2002,22（4）:279-282.

［10］俞一軍.DL-苯丙氨酸的合成和拆分［D］.杭州:浙江大學,2002.

［11］張靜夏,潘仕榮,王琴梅，等.5-氟脲嘧啶-聚［（2-羥乙基）-L-谷酰胺］的合成及釋藥研究［J］.中山醫科大學學報,2002,23（5）:19-21.

［12］阮敏,葉勇,石德清,等.含氨基酸席夫堿的5-氟尿嘧啶類衍生物的合成及Raman光譜分析［J］.光散射學報,2006,118（11）:48-53.

［13］Fisher G.H.,Aniello A.,Veer A.Free D-aspartate and D-alanine in normal and Alzheimer brain［J］.Brain Res.Buil.,1991,26（6）:983-985.

［14］Daniel W.A.,Mary G.,Sun H.L.,et al.D-amino acid levels in human physiological fluids［J］.Chirality,1993,5（5）:375-378.

［15］Kuroda M，Mimaki Y，Sashida Y，et al.Novel Cholestane Glycosides formthe Bulbs ofOrnithogalumsaundersiae and Their Cytostatic Activityon Leukemia HL-60 and MOLT-4 Cells［J］.Tetrahedron,1997,53（34）:11549-11562.

［16］Skehna P,StorengR，ScudieroD，et al.Newcolorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening［J］.J.Natl.Cancer Inst.，1990,82（13）:1107-1112.