環狀脂肪酸芽孢桿菌的檢測與控制研究進展

趙貴明 趙勇勝 楊海榮 陳穎

(中國檢驗檢疫科學研究院 北京 100123)

1 前言

環狀脂肪酸芽孢桿菌 (Alicyclobacillus spp.)(簡稱環脂酸芽孢桿菌)是廣泛存在于自然界中的一群耐熱、嗜酸并可形成芽孢的桿菌,該類菌在酸性環境 (如果汁中)生長良好,其芽孢甚至在 pH＜3.7的高酸性果汁中經受巴氏殺菌過程仍能存活[1]。1984年 Cerny等從腐敗的蘋果汁中分離出該類菌株,隨后研究確認該菌就是導致果汁腐敗的微生物[2]。事實上,早在 1971年就首次從酸熱環境中分離出該類芽孢桿菌[3],盡管該類菌對人類健康并不造成直接危害,但由其形成的芽孢萌發后在代謝過程中產生愈創木酚和鹵酚,1×10-12的含量就能造成果汁風味敗壞并產生輕微沉淀,因此如何消除果汁腐敗成為果蔬加工業關注的主要問題[4]。

對環脂酸芽孢桿菌的研究,過去集中在生物學特性、分類學方面,并且主要研究內容是在此基礎上的快速檢測和有效控制。然而,由于檢測方法不夠便捷,主要體現在檢測周期太長[5]或產生腐敗后才會被檢測出,因此,產品往往流通到消費者手中腐敗才會被發現;而在控制技術研究方面,現有生產工藝還不能完全滿足對環脂酸芽孢桿菌越來越嚴格的限量要求。本文就環脂酸芽孢桿菌的檢測方法及控制研究等方面進行系統分析和綜述。

2 環脂酸芽孢桿菌的基本生物學特性及其分類

了解環脂酸芽孢桿菌的基本生物學特性及其分類對檢測方法與控制技術的研究具有重要意義。

2.1 基本生物學特性

環脂酸芽孢桿菌除 A.sendaiensis是革蘭氏陰性菌外,其余均為革蘭氏陽性桿菌,部分菌在菌體老化后,革蘭氏染色具有可變性[6];除 A.pohliae有時表現出在厭氧條件下生長外,其他各種都是需氧條件下生長;絕大部分菌有動力;除 A.disulfidooxidans,A.tolerans和 A.ferrooxydans三株菌可在低于20℃生長外,該類菌的生長溫度范圍為 20-70℃,最適生長溫度范圍為 35-65℃。研究發現,該類菌細胞膜中獨特的ω-環己烷脂肪酸結構和藿烷化合物結構與其嗜酸耐熱特性相關。pH高低對該類菌的熱抗性會產生影響,D值隨 pH的下降呈線性下降。該類菌只要在 20℃以上就可在 pH2.5-pH6.0范圍內的培養基上生長,其芽孢則能在濃縮果汁和類似環境中存活相當長時間[1]。

2.2 分類

根據Bacillus acidocaldarius,Bacillus acidoterrestris,和 B acillus cycloheptanicus三株菌和相關芽孢桿菌的 16SrDNA基因序列分析結果,Wisotzkey申請了一個新屬,A licyclobacillusgen.nov.,即環脂酸芽孢桿菌屬[7],名稱也得到了相應更改,上述 3株菌是該屬的典型種,隨后研究者們在火山附近、土壤和酸敗的果汁中又陸續發現新種[5,8],然而,目前認為引起果汁腐敗的主要菌是該屬的酸土環脂酸芽孢桿菌(A.acidoterrestris)和酸熱環脂酸芽孢桿菌 (A.acidocaldarius)。

3 環脂酸芽孢桿菌的檢測方法

3.1 分離與計數

樣品制備、培養條件是影響環脂酸芽孢桿菌分離效果的主要因素。樣品制備包括稀釋和熱處理,尤其是熱處理,可以刺激芽孢萌發,研究表明,最佳效果是 80℃下作用 10min[9];樣品稀釋也十分必要,主要原因是果汁中的可溶性固形物會對該類菌的生長產生影響[10],1:10是通常采用的稀釋方式。培養條件的影響主要表現在環脂酸芽孢桿菌需要在酸性環境中生長,還需要刺激生長的某些礦物質。常用的培養基有 K氏瓊脂、YSG(yeast starch glucose)瓊脂、BAT瓊脂 (B acillus acidoterrestris agar)、BAM 培養基 (Bacillus Acidocaldariusmedium)、OSA培養基 (orange serum agar)、PDA培養基(patato destrose agar)等。

計數方法包括直接計數法和增菌培養法。直接計數法分濾膜法和涂布法,濾膜法適用于易過濾樣品,涂布法適宜于檢測高污染量的樣品[11];對低污染量同時又不適宜過濾的樣品,只能采取增菌后的定性檢測方法。

在樣品處理和計數方法確定后,所選擇的培養基就成為影響結果的主要因素。BAM培養基是分離出第一株環脂酸芽孢桿菌使用的培養基[2],也是目前ATCC推薦用于參考菌株復活和分離的培養基,主要用于分離 A.hesperidum,A.genom icspecies 1、A.genom icspecies2和 A.cycloheptanicus,也用于生長特性測定實驗;OSA培養基用于分離桔汁中的微生物,也包括環脂酸芽孢桿菌;PDA培養基分離的環脂酸芽孢桿菌具有良好的再生性,但必須將 pH值調至 3.5[12];YSG培養基用于分離酸性飲料中的環脂酸芽孢桿菌,是目前日本 NDM公司采用的培養基;K氏培養基對環酯酸芽孢桿菌屬內多個種具有較高回收率,是美國庫克實驗室、雀巢公司采用的培養基,經 AOAC測試,由于它能更快速的得到目標菌而且對菌株有良好的再生性,因此成為目前應用最為廣泛的培養基,也是國際果汁生產者聯合會 (IFU)標準方法中推薦的培養基[11]。Chang等還對 K氏培養基進行了改良,通過優化、改良后的 SK瓊脂比 K氏培養基具有更高靈敏度和低檢測限[13]。在對果汁中環脂酸芽孢桿菌的分離與計數研究中還發現,除單個培養基的不同特性影響之外,前增菌和分離環節中采用不同組合也會對分離結果產生影響[14]。

傳統方法判斷實驗結果的依據就是環脂酸芽孢桿菌在 pH ＜4.0(BAT培養基)可生長,而在 pH＞6.0時不生長,然而,除環脂酸芽孢桿菌以外是否還有其他芽孢桿菌也能在同樣生長條件下生長,這需要進一步研究。

3.2 分子生物學檢測方法

Christopher基于環脂酸芽孢桿菌屬 16SrRNA基因序列建立了檢測果汁產品中環脂酸芽孢桿菌的實時熒光 PCR方法[15]。Christopher采用文獻中提出的 (Weisburg et al.,1991)8F和 1492R引物,以3株環脂酸芽孢桿菌代表性菌株 ATCC43030、ATCC49025和 ATCC49029的 DNA為模板,通過常規 PCR方法擴增出 1500bp的 16SrRNA,然后進行克隆測序 (GenBank編號分別為 AY573796,AY573797和 AY573798),根據序列設計引物和熒光探針 ,CC16S-F,5’CGTAGTTCGGATTGCAGGC3’,CC16S-R,5 ’GTGTTGCCGACTCTCGTG3 ’,探 針CC16S-探針5’CGGAATTGCTAGTAATCGC3’。特異性檢測實驗表明,檢測的目標菌能夠覆蓋環脂酸芽孢桿菌屬,檢測樣品可以是肉湯培養物或果汁,在少于 100個菌時仍能檢測,并且和其他食源性致病菌無交叉反應。在目前的傳統方法只能通過生長試驗、缺乏特殊鑒定手段的情況下,分子生物學方法不失為一種可靠的鑒定手段。

3.3 傅里葉紅外光譜技術

Elizabeth等應用衰減全反射紅外光譜技術 (attenuated total reflectance infrared microspectroscopy,ATR-I R)建立了簡單、快速和靈敏的環脂酸芽孢桿菌檢測方法[16]。在建立方法過程中,將環脂酸芽孢桿菌的稀釋液通過疏水網膜過濾,再將疏水網膜置于 OSA培養基上在 50°C下培養 36-48h后進行真空干燥,然后使用 ATR-IR光譜儀采集圖譜后采用過變量分析方法進行分析。結果顯示,通過簇類獨立軟模式法,可以將環脂酸芽孢桿菌區分到種或株的水平,在盲測試驗中可 100%預測環脂酸芽孢桿菌,顯示了較好的準確性,同時縮短了檢測時間。ATR-I R作為篩選方法可用于果汁加工業,但所需設備費用較高。Hamzah等將傅立葉變換紅外 (FT-I R)光譜技術與多元統計方法相結合建立了鑒定和檢測蘋果汁中環脂酸芽孢桿菌的方法[17],實驗結果表明,通過對主成分 (PCA)進行聚類分析能夠明顯區分環脂酸芽孢桿菌。

3.4 愈創木酚的測定方法

前文已提到,環脂酸芽孢桿菌在導致果汁腐敗時會產生特殊的氣味,其主要成分為愈創木酚 (2-methoxyphenol)。利用愈創木酚具有揮發性的特點,可采用傳感器、分析和化學等方法進行檢測。

3.4.1 傳感器方法

最好估測閾值 (best estimated threshold,BET)是反映傳感器靈敏度的關鍵指標,在對水和果汁中愈創木酚的氣味測定方法研究中,早期的 BET較低,僅為 13.00×10-9和 21.00×10-9,近期 siegmund報道了檢測蘋果汁中愈創木酚的 BET為 0.57×10-9[18],這是迄今為止利用傳感器檢測蘋果汁中愈創木酚最為靈敏的報道。研究發現,檢測靈敏度產生較大差異的原因,除傳感器本身因素以外,不同基質對檢測靈敏度的影響范圍約 500倍[18]。隨著技術的不斷發展,電子鼻已用于軟飲料中環脂酸芽孢桿菌的測定[19]。

3.4.2 分析方法

在利用高效液相色譜法 (HPLC)、氣相色譜法(GC)檢測愈創木酚的研究中,樣品提取與制備方法有多種,頂空固相微萃取法 (HS-SPME)是目前一項通用的萃取技術。氣相色譜儀常常與其他檢測系統如火焰電離探測器 (GC-FI D)、嗅覺測量器、質譜儀 (MS)聯用。鑒于質譜儀的特異性、精確度、高靈敏度的特點,GC-MS得到廣泛使用。Zierler建立了蘋果汁中酸土環脂酸芽孢桿菌 (A.acidoterrestris)產生的愈創木酚和 2,6-二溴苯酚 (2,6-DBP)的 HS-SPME GC-MS[20],通過優化參數,該方法對二者的檢測限為 0.29μg/L和 0.08μg/L;定量限為 1.06μg/L和 0.27μg/L,但是目前的方法缺乏愈創木酚或鹵酚與環脂酸芽孢桿菌之間的數量對應關系。

3.4.3 化學方法

通過過氧化物酶試驗可以用來確定分離菌株從香草酸中產生愈創木酚的能力。除已知的 A.acidoterrestris,A.herbarius,A.herbarius外,并不是所有的環脂酸芽孢桿菌菌株均有產生愈創木酚的能力,試驗結果會隨著接種量和菌種進行變化。因此,在試驗過程中需分別設置陽性對照和陰性對照,如 A.acidoterrestris,A.acidocaldarius與被測分離物在同等條件下進行測試,如果結果不確定,加大接種量或延長培養時間重新進行檢測[11]。

4 環脂酸芽孢桿菌的控制技術

對環脂酸芽孢桿菌芽孢和菌體的抑制包括普通方法和特殊方法。過去將化學藥品與熱加工工藝結合使用被認為是抑制環脂酸芽孢桿菌芽孢的有效方法,然而,隨著人們綠色消費觀念的轉變,目前已逐漸從使用化學藥品轉向使用合成添加劑和無害的成分。

4.1 普通方法

4.1.1 有機酸和苯甲酸鈉

Hsiao和 Siebert研究了常用有機酸的抗 A.acidoterrestris的效果,實驗表明效果依次是苯甲酸、奶油中提取的羊脂酸、乙酸、檸檬酸 -蘋果酸 -乳酸-酒石酸[21]。由于該菌要求的酸性 pH生長條件能增強苯甲酸鈉的抑菌效果,因此 Bevilacqua建議使用的濃度為 0.1-0.5g/L[22]。

4.1.2 氧化劑·Nisin·溶菌酶

多種氧化劑對A.acidoterrestris芽孢具有抗菌效果[23],抗菌效果依次為 NaOCl-H2O2＞NaCl O2＞Na3PO4。FDA允許使用 ClO2(50-200×10-6)作為洗滌水果和蔬菜的消毒劑,但用于蘋果表面則效果較差;Lee等提出使用 ClO2氣體作為消毒劑,并且用低濃度、中等濃度和高濃度的 ClO2氣體進行了實驗,處理 1h后,低濃度 (0.3mg/L)減少了初始芽孢2.7個對數值;中濃度 (1.78mg/L)和高濃度 (4.32 mg/L)的效果更為顯著,減少了 5個對數值[24]。

Nisin是一種乳酸鏈球菌素 (亦稱乳鏈菌肽)的天然生物活性抗菌肽,對革蘭氏陽性菌表現出廣譜抑菌效果,近年來被作為一種天然防腐劑而用于食品工業。該抗生素可直接添加到果汁中抑制 A.acidoterrestris及其芽孢的生長,用量范圍為 1.25-100 I U/mL,效果取決于介質的 pH、果汁的種類以及固形物的成分。Nisin對芽孢的效果比對菌體的作用效果更好一些,原因是 Nisin的存在增加了芽孢對熱的敏感度[25]。

溶菌酶對許多細菌有效,A.acidoterrestri也會受到溶菌酶的強烈影響 (0.25-2.0g/L),而且芽孢比菌體更敏感。實驗表明,在溶液中加入溶菌酶后,檢測不出環脂酸芽孢桿菌的芽孢,但是芽孢所處的介質也影響溶菌酶的生物活性[26]。

4.1.3 甘油單月桂酸酯·殼聚糖·香精油

Altieri等研究了低劑量的甘油單月桂酸酯對A.acidoterrestri的作用效果。在將麥芽浸粉肉湯的pH調整到 4.5時,測量了 A.acidoterrestri的生長情況,發現甘油單月桂酸酯對 A.acidoterrestri的菌體影響效果更明顯,根據延長的細菌停滯期推斷出減少的細菌生長指數最高為 48%,但相同的活性濃度對芽孢則沒有同樣的效果。

小分子量殼聚糖 (50-190kDa,75-85%脫乙酰度)對 A.acidoterrestri也具有抑制效果,培養基中最佳加入量為 1.4g/L,如果數量再低則對芽孢萌發沒有效果[27]。

Takahashi等試驗了用桉 (樹)屬植物的葉子提取物和黃酮類化合物抑制 A.acidoterrestri的效果,發現最小抑制濃度的范圍為 7.8-31g/L。然而香精油的成分組成變化較大,主要取決于提取的方式、植株本身的差異以及生長的氣候條件,因此,抑制A.acidoterrestri的有效成分應當是香精油的活性成分,活性成分的功效依次為肉桂醛、丁香酸、檸檬油精[28]。

4.2 特殊方法

熱加工工藝作為唯一控制酸性飲料中的A.acidoterrestri以及抑制其芽孢萌發的方法已研究很長一段時間了,普遍采用的技術如下。

4.2.1 高靜液壓技術和高壓均質技術

高靜液壓技術用于 A.acidoterrestri芽孢及菌體的滅活已被許多專家廣泛建議使用:50℃,分別在350和 450MPa壓力通過熱處理,菌體可減少 3.53和 4.73個對數值,熱處理效果嚴格受到溫度和時間的影響。芽孢滅活通常分為兩個階段,第一階段是如何減少芽孢萌發,第二階段是如何使已萌發的芽孢滅活。由于果汁加工過程中經過了巴氏殺菌,因此在果汁中能夠生存的就是A.acidoterrestri的芽孢。一種可供選擇的方法是將高靜液壓技術與其他無害但可以有效抑制芽孢萌發的物質結合使用,在減少芽孢萌發的情況下,以較低的壓力破壞菌體細胞[29]。

高壓均質技術也被運用于抗 A.acidoterrestri及其芽孢的研究當中,實驗顯示,500-1700bar的壓力范圍,可以明顯減少 1-2個對數值的試驗初始菌數[30]。

4.2.3 輻照和微波技術

Nakauma等應用輻照 (電子束和伽馬射線)結合傳統的熱處理工藝對滅活 A.acidoterrestri芽孢進行了研究。通常如果經過熱加工處理,芽孢會迅速較少大約 1-1.5個對數值,但是到了第二階段,則不能全部殺滅高抗性的芽孢。如果將輻照技術與傳統熱處理方法結合使用,由于輻射加快了芽孢的熱休克,因此就可以減少熱處理時間,如 95oC下達到減少芽孢 4個對數值的時間是 188min,經 2.0kGy劑量輻照后,達到同樣效果的熱處理時間就可以縮短到 23min[31]。

微波也可用于抑制細菌芽孢形成,研究者將 A.acidoterrestri接種在含橄欖油的蘆薈膏狀物中,在 80-100%強度 (2450MHz-900)加工 5-7min,A.acidoterrestri的芽孢數量可減少 2個對數值[32]。

5 結語

在檢測方面,盡管目前細菌的分離鑒定方法有多種,不同原理采用的方法均有各自的特點,但就A.acidoterrestri而言:①傳統分離方法根據其獨特的生物學特性,僅依靠在低 pH上是否能夠生長進行判斷,既不如生化反應等鑒別手段便捷,試驗數據似乎也不夠充分,況且,除該類菌外是否還有其他菌能夠在特定的培養基上生長,尚是個未知數。②雖然通過愈創木酚實驗可以確證,但是不同菌株之間的差異或并非全部環脂酸芽孢桿菌都產生愈創木酚會使結果出現偏差,此外,整個實驗所需時間較長也是一大弱點;傳感器或儀器方法盡管較快,但是,對不產生愈創木酚、二溴苯酚的同類菌株則無法探測,因為該屬中雖然主要是 A.acidoterrestri產生上述物質,但如果該屬其他菌繁殖,也會導致果汁產生沉淀,同時,就污染源而言,也預示著存在產生腐敗氣味菌株的可能。③利用分子生物學原理進行最終的鑒定也許是目前較為實用的方法。④如果對傳統方法進行改進,比如利用細菌產生的特異性酶,將增加方法的保險系數;另外利用分子生物學方法對其進行分型,對污染源的控制將會起到更好的作用。盡管研究集中在 A.acidoterrestri這一種菌上,但極有可能還存在導致果汁腐敗的其他菌種。

在控制方面,盡管控制果汁中腐敗菌的方法有多種,但目前大部分均限于實驗室規模,進入實用性階段尚有一段距離。就目前的研究結果而言,任何單一方式均存在一些缺陷,普遍問題就是不能做到全部殺滅 A.acidoterrestri,尤其是該菌形成的芽孢。多種方法協同使用并根據生產企業自身條件,才能最大程度消除果汁的腐敗的微生物。

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