VEGF對內皮抑素誘導的血管內皮細胞凋亡的抑制作用

馬 穎,何援利

（南方醫科大學珠江醫院婦產科,廣州510280）

子宮內膜異位癥（endometriosis,EMs）是育齡期婦女的多發病,主要表現為痛經及不孕,危害嚴重。EMs雖是一種良性病,卻具有易增生、浸潤和復發的惡性特點,目前治療效果有限[1-2]。有研究提示EMs與血管生成關系密切,抑制血管生成可以達到抑制病灶生長的目的。內皮抑素（endostatin,ES）是一種強效的抗血管生成物質,可誘導血管內皮細胞凋亡,但ES蛋白不穩定,需借助基因治療發揮作用[3-4]。血管內皮細胞生長因子（VEGF）可抑制ES誘導的血管內皮細胞凋亡。為探討血管生成在EMs中的作用,本研究構建了攜帶ES基因的重組腺病毒,體外感染臍靜脈內皮細胞ECV-304并誘導其凋亡,同時觀察VEGF對這一現象的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Pshuttle-ES質粒由本科保存。大腸桿菌BJ5183、AAV293細胞株、ECV-304細胞由中山大學生命科學院提供。腺病毒AdEasy-1系統,包括骨架質粒pAdEasy-1及穿梭質粒pAdT rack-CMV。限制性內切酶PmeⅠ、PacⅠ為NEB公司產品；蛋白酶K為Sigma公司產品；質粒抽提試劑、DNA膠回收試劑盒為Omega公司產品；Trizol試劑盒、LipofectAMINE2000、DM EM培養基、RPM I-1640培養基為Gibco公司產品；Taq DNA聚合酶、T4DNA Ligase、限制性內切酶KpnⅠ、XbaⅠ為TaKaRa公司產品；鼠抗人內皮抑素單克隆抗體為Oncogene公司產品、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗小鼠IgG為中北京山生物工程公司產品。DNA序列測定由中山大學生命科學院測序中心完成。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒Ad-ES的構建、包裝、純化、滴度及感染效率測定 以Pshuttle-ES質粒為模板,PCR擴增出ES片斷（約650bp）,構建重組穿梭質粒pAdTrack-ES,在大腸桿菌BJ5183中構建重組腺病毒質粒pAd-ES。同法,制備出無外源基因插入的空載質粒pAd-T rack。pAd-ES轉染85%～90%融合的AAV293細胞,約14d后收集細胞,-80℃、37℃反復凍融,收集腺病毒Ad-ES,經用氯化銫密度梯度離心純化。終點稀釋法測定病毒滴度（Titer）。同法得到空載腺病毒Ad-Track。以1×104密度接種ECV-304于6孔板,用感染復數（multiplicity of infection,MOI）分別為1、10、100的Ad-ES感染,48h后在熒光顯微鏡下計數綠色熒光蛋白（GFP）陽性細胞百分率,測定病毒的感染效率。

1.2.2 RT-PCR及Western blot檢測ES的轉錄和表達 Ad-ES（MOI=100）感染85%～90%融合的ECV-304,72h后收集細胞,用Trizol試劑盒抽提總RNA,加入無RNase的DNaseⅠ37℃孵育10min后,于70℃滅活15min。用獲得的RNA進行逆轉錄,取2μ L cDNA產物為模板進行ES基因的PCR擴增。同樣將感染的細胞沉淀經 SDS-PAGE電泳及 Western blot檢測；Ⅰ抗為鼠抗人內皮抑素單克隆抗體（1∶50）,Ⅱ抗為HRP標記的羊抗小鼠IgG（1∶100）,DAB法顯色。

1.2.3 VEGF對ES誘導的ECV-304凋亡的抑制作用測定分組：（1）實驗組為Ad-ES+VEGF（10ng/mL）組；（2）陰性對照組為Ad-ES組；（3）空白對照組為Ad-Track組。各組細胞感染72h后,用胰酶處理得到單細胞懸液。加入200μ L的RNase酶（1g/L）,37℃水浴30min,再加入800μ L的PI染色液4℃避光放置30min,用流式細胞儀檢測凋亡細胞的特征性亞二倍體峰。各組細胞感染72h后加入Hochest 33258染液（7.5μ g/mL）避光染色15～20min；再用-20℃預冷的PBS清洗細胞2次,棄上清液,熒光顯微鏡觀察核染色及凋亡小體的情況。10%甲醛（formalin）固定細胞20min,加入0.1g/L結晶紫染液染色30min,用10%冰醋酸2mL抽提,抽提液與雙蒸水混勻,在酶標儀上讀取590nm處吸光度值,繪制細胞生長曲線圖。

1.3 統計學處理 采用SPSS10.0統計軟件進行Dunnett t檢驗。

2 結果

2.1 重組腺病毒Ad-ES的包裝過程 重組腺病毒質粒pAd-ES轉染AAV293細胞16h后,在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白（GFP）表達,熒光逐漸增多增亮,轉染后5～9d,細胞膨脹變圓,觸角逐漸消失,熒光不再增加,部分細胞開始懸浮,呈串珠樣改變,表明病毒的形成和擴增；約在轉染后14d,大部分AAV293細胞胞體固縮、懸浮,見封3圖1～4。

2.2 ES的轉錄和表達 Ad-ES感染的ECV-304細胞有ES片段的擴增,而空白對照組無特異性條帶產生,表明插入的ES基因在mRNA水平能有效轉錄,見圖5。以MOI=100的Ad-ES感染ECV-304,約20kD處有特異性條帶,與ES蛋白的相對分子質量一致,證明Ad-ES在ECV-304中有效地的表達,見圖6。

圖5 RT-PCR檢測ES在ECV-304細胞中的表達

圖6 Western blot檢測ES蛋白的表達

圖7 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況

圖9 各組細胞生長曲線

2.3 各組細胞凋亡情況 Ad-ES感染ECV-304細胞72h后出現細胞凋亡特征性的亞二倍體峰,Ad-ES+VEGF組細胞凋亡減少,Ad-Track組未見明顯細胞凋亡,見圖7。Ad-ES感染ECV-304細胞72h后出現大量的凋亡小體,Ad-ES+VEGF組凋亡較少,Ad-Track組無明顯凋亡,見封4圖8。

2.4 各組細胞生長曲線 繪制不同處理時間的各組細胞生長曲線,Ad-ES組細胞增殖速度明顯低于Ad-Track組和Ad-ES +VEGF組,而后兩組細胞增殖速率相似,差異無統計學意義（P＞0.05）,見圖9。

3 討論

EMs是一種危害嚴重、治療困難的多發病,其發病機制不明。多項研究提示,新生血管生成是異位內膜病灶存在與發展的前提,抗血管生成治療有望成為治療EMs的有效途徑之一。

ES是一種強效的抗血管生成物,可誘導血管內皮細胞凋亡并抑制其遷移,但ES蛋白不穩定,必須借助基因治療發揮作用?；蛑委煹年P鍵環節就是選擇高效安全的基因載體,本研究采用的腺病毒AdEasy-1系統是一種高效安全的基因載體,其安全、遺傳毒性低,控制轉錄復制單位E1基因和編碼毒性產物E3基因已被剔除,故不會自身復制；感染率高,易繁殖,宿主廣泛；不整合到宿主細胞的染色體中,因而不會帶來嚴重的不良反應[5-7]。VEGF具有強大的促內皮細胞增殖、促血管生成作用,可對抗ES誘導的細胞凋亡作用。多項研究提示VEGF的過表達可能是導致EMs發生的重要因素[8]。

在本研究中,成功構建并在AAV293細胞中包裝出攜帶ES基因的重組腺病毒Ad-ES,感染ECV-304細胞后,用RTPCR及Western blot檢測到ES的轉錄和表達,細胞生長曲線及流式細胞術證實Ad-ES感染后的ECV-304細胞增殖速度明顯下降并出現凋亡,如果同時加入VEGF,則細胞凋亡明顯減少。提示ES能夠改變ECV-304細胞的生物活性,使其凋亡增加,這可能是ES抑制血管生成的重要機制之一；而上述作用能夠被VEGF所對抗,從另一個方面說明ECV-304細胞受ES影響而發生變化,為進一步研究EM s血管生成機制奠定了基礎。

[1]朗景和.子宮內膜異位癥的研究與設想[J].中華婦產科雜志,2003,38（8）：478-480.

[2]Nothnick WB.Endometriosis：in search of optimal treatment[J].Minerva Ginecol,2010,62（1）：17-31.

[3]Karamouzis MV,Moschos SJ.The use of endostatin in the treatment of solid tumors[J].Expert Opin Biol Ther，2009,9（5）：641-648.

[4]May K,Becker CM.Endometriosis and angiogenesis[J]. Minerva Ginecol,2008,60（3）：245-254.

[5]Sharma A,Tandon M,Bangari DS,et al.Adenoviral vector-based strategies for cancer therapy[J].Curr Drug ther,2009,4（2）：117-138.

[6]Hogg RT,Garcia JA,Gerard RD.Adenoviral targeting of gene expression to tumors[J].Cancer Gene Ther,2010,17（6）：375-386.

[7]Becker CM,Sampson DA,Rupnick MA,et al.Endostatin inhibits the growth of endometriotic lesions but does not affect fertility[J].Fertil Steril,2005,84Suppl 2：S1144-1155.

[8]Takehara M,Ueda M,Yamashita Y,et al.Vascular endothelial growth factor A and C gene expression in endometriosis[J].Hum Pathol,2004,35（11）：1369-1375.