重癥急性胰腺炎大鼠胃竇肌間神經叢一氧化氮合酶陽性神經元的變化

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）是消化系統常見的危重癥疾病之一。有研究表明腸神經系統（ENS）在胃腸動力衰竭中起一定作用。本研究擬測定大鼠胃排空率及胃竇肌間神經叢一氧化氮合酶（NOS）陽性神經元的數目變化,探討SAP對胃竇肌間神經叢NOS陽性神經元的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：成年SD雄性大鼠30只（由桂林醫學院動物實驗室提供）,體質量220～250g。隨機分為兩組,假手術組10只,模型組20只。（2）試劑：?；悄懰徕c（Sigma公司）,Anti-Human Neuronal Protein HuC/HuD（anti-HuC/HuD,MolecularProbes公司）,NOS1（R-20,Santa Cruz公司）,TRITC標記山羊抗兔IgG（H+L）、FITC標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術有限公司）,酚紅糊劑（0.4%酚紅試液按每15mL加1g面粉的比例加熱調成糊劑,天津科密歐化學試劑開發中心）,NaOH、Ba（OH）2·8H2O、ZnSO4廣東汕頭西隴化工有限公司）等。（3）儀器：解剖顯微鏡（stemi 2000-CS,SIP NO.MIC 00945,蔡司光學儀器上海國際貿易有限公司）,Olympus正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯儀器公司）,L1braS32PC紫外分光光度計（Biochrom公司）等。

1.2 方法

1.2.1 SAP模型的建立 造模前大鼠禁食24h,可自由飲水,術前4h禁水,予25%氨基乙酸4mL/kg腹腔內注射麻醉,開腹,辨認胰膽管及十二指腸乳頭開口處；在腸系膜對側腸壁上選一無血管區,用磨去針尖的四號半針頭經十二指腸乳頭開口處滑行探入胰膽管,順其走向推進4～5mm后,用動脈夾夾住胰膽管開口處及近肝門部膽管,接微量泵逆行泵入5%?；悄懰徕c（1mL/kg,0.1mL/min）2～3min,即可見胰腺充血、水腫、胰膽管擴張,停止泵入?；悄懰徕c,維持8～10min后,松開動脈夾、拔針,將腸管復位,分層關腹；術后皮下補液（生理鹽水10mL）。

1.2.2 胃排空率的檢測 造模 24h后,灌入酚紅糊（1mL/100g）,20min后處死大鼠,結扎胃賁門與幽門,取胃,順胃大彎縱向剪開,在冷0.85%NaCl溶液中洗脫酚紅糊分裝于試管中,洗脫液6mL加0.3mol/L Ba（OH）2溶液和5%Zn-SO4溶液各2mL,充分混勻,3000r/min離心10min,取4mL上清液加入10%NaOH 0.5mL混合,用紫外分光光度計于560nm比色,測吸光度,即為胃中酚紅吸光度（OD）值,計算胃酚紅殘留率,以胃酚紅殘留率為指標評價胃排空率。另取0.4%酚紅1mL,加蒸餾水1mL,以10%NaOH 0.5mL的OD為標準值計算胃排空率（%）,胃排空率（%）=（1-樣品OD560/標準OD560）×100%。

1.2.3 胃竇肌間神經叢標本的制作 （1）具體步驟：將剪開的胃再次用冰Kreb液沖洗干凈,使漿膜面朝上,平鋪并適當伸展固定于木板上,用Stefanini固定液4℃固定24h；PBS緩沖液沖洗后,將胃竇部修剪成約0.4cm×0.8cm大小,將漿膜、肌層一同撕下,去掉附著的斜行肌、環行肌纖維,充分暴露肌間神經叢,將標本貼附于載玻片上,即制成標本。（2）雙重免疫熒光染色：將制備好的胃肌間神經叢標本用含0.5%Triton X-100、10%正常山羊封閉血清的PBS室溫孵育30～60min；anti-HuC/HuD（10μ g/mL）4℃孵育 24h；NOS1（R-20，1∶100）4℃孵育24h；FITC標記山羊抗小鼠 IgG（1∶100）22℃孵育45min；TRITC標記山羊抗兔IgG（1∶200）22℃孵育45min；甘油封片。每一道程序后均用PBS洗滌3次,每次10min。（3）染色結果判斷：用Hu蛋白為神經元標志物顯示所有神經元,用NOS1（R-20）顯示陽性神經元；用TRITC（紅）、FITC（綠）標記的二抗顯示不同的一抗；用熒光顯微鏡觀察并計數各自陽性細胞數,計算每200個神經元細胞中NOS神經元陽性細胞所占百分比。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。分別進行正態分布檢驗,然后進行t檢驗,數據以±s表示,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 假手術組大鼠一般狀況較好,術后無死亡發生。模型組大鼠一般狀況差,出現精神萎靡、反應遲鈍、懶動、呼吸急促等表現,6h死亡2只,12h死亡5只,24h死亡11只。

2.2 兩組大鼠胃排空率比較 見表1。

2.3 胰腺組織大體改變 模型組誘導10min胰腺呈現廣泛被膜下出血水腫,24h胰腺組織廣泛出血壞死,范圍擴大,胰腺周圍大網膜及腹膜有較多皂化斑點,腹腔內大量血性腹腔積液。術后剖腹見假手術組胰腺肉眼觀察呈淡粉紅色,顏色均勻一致。

2.4 組織病理學觀察 模型組胰腺腺泡細胞腫脹,可見灶性壞死,腺泡細胞間有大量炎細胞浸潤；小葉排列紊亂,其間充斥炎性滲出；壞死區內腺泡結構消失；葉間隙增寬,間質微血管破裂,紅細胞溢出。假手術組除部分胰腺腺泡細胞水腫外,小葉結構存在,間質清晰,間質內偶見炎細胞浸潤,見表1、封4圖1。

表1 兩組大鼠各項指標測定結果比較（±s）

表1 兩組大鼠各項指標測定結果比較（±s）

*：P＜0.05,**：P＜0.01與假手術組比較。

組別 n 胰腺組織病理評分（分）NOS陽性神經元的表達（%）胃排空率（%）假手術組10 1.7±0.7 17.03±4.15 71.58±3.89模型組 9 15.6±1.2* 25.19±2.84* 31.33±6.30**

2.5 大鼠胃竇肌間神經叢標本染色情況 熒光顯微鏡觀察大鼠胃竇肌間神經叢主要由神經元和神經纖維構成。全層標本經anti-HuC/HuD染色后觀察,神經元胞體形態多樣,呈卵圓形、三角形及不規則形,大小不一；胞質、胞核均染為綠色,神經纖維不著色。標本經NOS1（R-20）染色后觀察,神經元胞體大小不等,形態多樣；胞質呈紅色,胞核不著色,神經纖維著色呈網格狀分布。NOS陽性神經元所占比例明顯增加。與胃竇肌間神經叢相比,回腸神經元細胞較小,多呈條索樣分布,神經纖維多呈“井”字分布,而結腸處于兩者之間,見封4圖2。

3 討論

SAP是臨床上消化系統疾病常見的急危重癥之一。胃腸運動障礙是SAP的重要表現。ENS是控制胃腸運動的一個獨立的整合系統。NOS神經元是來自ENS的主要抑制性神經元,分泌的一氧化氮（NO）具有重要的松弛胃腸道平滑肌作用。NOS是NO合成的限速酶。NOS抑制劑可清除壓力誘導的胃容受性舒張,說明NO能誘導胃舒張,抑制胃的運動[1],有研究表明迷走神經切斷后胃電頻率及正常電活動百分數較對照組顯著下降,提示迷走神經對胃肌電活動的影響可能是由傳出纖維介導[2]。神經型一氧化氮合酶（nNOS）被發現沉積在小鼠胃迷走神經傳入末梢,NO抑制上皮神經調節作用與選擇性作用于迷走神經末梢有關[3]。NO還參與胃慢波的調控[4]。胃動素（motilin,M TL）是胃竇Ⅲ相移行運動復合波（MMC）的啟動因素[5],胃壁和十二指腸肌間神經叢中發現有M TL陽性神經元和神經纖維[6]。大部分的MTL受體（68.9%）為nNOS陽性神經元[7],胃竇肌間神經叢多為 nNOS陽性神經元[8],相關實驗也證實SAP大鼠結腸的NOS陽性神經元細胞增多[9]。但SAP胰腺組織以結構型一氧化氮合酶（cNOS）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）升高為主[10]。已有研究發現SAP患者血清NO水平升高[11],而血清中的NO部分來源于ENS,本研究結果證實SAP大鼠胃竇nNOS陽性神經元增多,推測胃竇肌間神經叢NOS陽性神經元參與了ENS的重塑。但SAP胃運動障礙受多因素影響,其機制仍不完全清楚。

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