IVF-ET周期中2、4細胞卵裂球多核細胞發育情況及胚胎移植后妊娠結局觀察

陳磊，蔣如煜，王珊珊

南京大學醫學院附屬鼓樓醫院，南京 210008

單胚胎移植(SET)是降低多胎妊娠危險性的重要手段之一。如何挑選最具發育潛力的胚胎，提高體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率是目前胚胎學家的研究重點。根據ESHRE共識[1]，分裂期胚胎評估的主要參數有第3天胚胎卵裂球數目及大小均一性、碎片、空泡等。最新研究[2]報道，受精第2天胚胎卵裂球單核可能是獨立反應優質胚胎的新標志。人類胚胎發育早期時卵裂球多核是一種常見現象。但第一次有絲分裂與第二次有絲分裂后出現的卵裂球多核通常被認為是一種胚胎異常情況，50%以上的卵裂球多核胚胎是非整倍體、嵌合型及更加復雜的混合型，可降低IVF-ET周期中的囊胚形成率、種植率[3]。目前臨床評估胚胎形態學常采用倒置顯微鏡，卵裂球核狀態的評估受限。時差成像技術(TLI)可使胚胎學家獲取更多胚胎發育相關的細節性參數。TLI檢測的具有卵裂球多核的胚胎中，高達72.3%多核胚胎的在ESHRE/ALPHA共識規定時間范圍內不能被識別[4]。目前，國內針對胚胎卵裂球多核現象的研究大部分集中于4細胞階段，2細胞卵裂球多核是否影響胚胎發育的相關研究較少。因此，我們采用TLI動態觀察了卵裂早期卵裂球多核情況，評價其囊胚期胚胎質量，探討2、4細胞卵裂球多核對胚胎發育及母體妊娠結局的影響?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年3月～2017年10月間在南京鼓樓醫院殖醫學中心行IVF-ET的患者96例，納入標準：①年齡< 35歲；②基礎FSH<10 IU/L；③獲卵數5～15枚；④女方不孕原因均為盆腔輸卵管因素；⑤周期數< 2個。排除標準:①存在部分或完全受精失敗周期史；②男性因素不育；③1～3C或2～5C出現異常分裂的胚胎者?；颊呔蠭VF治療。納入者一般資料比較具有可比性，均簽署知情同意書。

1.2 體外受精及胚胎培養 采用常規促排方案[6]，B超監測卵泡生成發育，待優勢卵泡直徑18 mm以上，行陰道B超引導下卵泡穿刺獲卵。將獲得的卵冠丘復合體充分洗滌后放入IVF培養皿孵育3 h，與精子按1∶100 000的比例共孵育5 h，機械法剝除顆粒細胞，鏡下觀察到卵細胞第二極體釋放，判斷受精成功，受精成功后將卵細胞轉移至含G1培養液的Slide皿中，置于Embryo Scope培養系統中培養到第3天。

1.3 卵裂早期卵裂球多核情況觀察 于受精(17±1)h時采用TLI系統鏡觀察胚胎卵裂早期卵裂球多核情況。本研究采用TLI系統是Embryo Scope(Vitrolife ，瑞典)[5]，整套系統包括三個部分：培養系統、分析軟件及耗材，拍照頻率10 min/次，可記錄胚胎發育過程中原核變化情況、卵裂方式與時間，專用培養皿為12孔皿。根據鏡下早期卵裂球核特征將其分為無多核胚胎(A組)、2細胞卵裂球多核者(2細胞一個卵裂球多核及4細胞無多核、2細胞均有多核及4細胞無多核胚胎，B組)、4細胞卵裂球多核者(2細胞一個卵裂球多核及4細胞至少一個卵裂球多核、2細胞均有多核及4細胞期至少一個卵裂球多核胚胎，C組)、2細胞無多核且4細胞至少一個卵裂球多核胚胎者(D組)。

1.4 囊胚期胚胎質量評價 培養第3天評價各組胚胎質量，計算各組培養第3天優質胚胎率，培養第3天優質胚胎標準：8個≤細胞數≤10個,卵裂球大小均勻，碎片<10%。 培養第5、6天根據ALPHA/ESHRE指南評價囊胚期胚胎質量[7]，根據囊胚腔擴張程度將囊胚分為1～6級，同時根據內細胞團大小與滋養層細胞數劃分A～C級，本研究將囊腔擴張在4級以上，且內細胞團與滋養層不同時為C級的胚胎歸為可利用囊胚。培養第5、6天測算各組可利用囊胚率。

1.5 胚胎移植及妊娠結局觀察 在一個移植周期中，優先挑選無卵裂球多核胚胎進行移植。本研究中，如果患者一個周期中存在無卵裂球多核的胚胎且分裂方式正常，則優選這個胚胎進行移植，如果在一個周期中，僅有幾個分裂方式正常但都存在早期卵裂球多核，則優先移植2細胞多核，4細胞無多核，且卵裂球多核數量越少越好，移植胚胎選擇順序為A、B、C、D組。本研究移植的均為第3天分裂期胚胎。移植14 天時抽取患者空腹外周血，檢測血HCG>5 IU/L為生化妊娠，移植4～6周時B超下見孕囊及胎心為臨床妊娠。臨床妊娠者隨訪觀察妊娠結局。計算妊娠率、流產率及活產率。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行處理。組間均數比較采用t檢驗，組間率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

共通過 TLI進行培養96個周期，最終納入613個胚胎。613個胚胎根據卵裂早期卵裂球多核情況分為A組276個、B組160個(其中2細胞一個卵裂球多核及4細胞無多核胚胎73個、2細胞均有多核及4細胞無多核87個)、C組140個及D組37個。培養第3天，A、B、C及D組優質胚胎率分別為54.35%(150/276)、34.38%(55/160)、21.43%(30/140)及24.32%(9/37)，與其他各組比較，培養第3天，A組優質胚胎率最高(P均<0.05)；與B組比較，C組優質胚胎率降低(P均<0.05)。培養至第5天，A、B、C及D組可利用囊胚率分別為50.91%(84/165)、34.65%(44/127)、20.63%(23/128)、13.51%(5/37)，培養至第6天，A、B、C及D組可利用囊胚率分別為35.76%(59/165)、18.11%(23/127)、8.60%(11/128)、0(0/37)，培養至第5、6天，與其他各組比較，A組可利用囊胚率最高(P均<0.05)；與B組比較，培養第5、6天C組可利用囊胚率降低(P均<0.05)。

最終A組進行72個周期胚胎移植，A組年齡(31.4±4.29)歲，BMI(22.46±3.11)kg/m2,基礎FSH(7.47±2.06)IU/L,基礎LH(4.84±2.14)IU/L,內膜厚度(10.72±2.39)mm，獲卵數(11.36±2.55)個，移植成功率58.33%(42/72)，流產率7.14%(3/42)，活產率54.17%(39/72)。B組共進行8個周期胚胎移植，其中2細胞一個卵裂球多核及4細胞無多核胚胎4個，移植者年齡(32.50±3.20)歲，BMI(20.76±1.71)kg/m2,基礎FSH(7.11±1.29)IU/L,基礎LH(6.77±2.12)IU/L,內膜厚度(9.00±1.22)mm，獲卵數(12.37±2.48)個，3例患者種植成功，0例流產，3例均為活產；2細胞均有多核及4細胞無多核胚胎4個，移植者年齡(29.5±2.87)歲，BMI(21.90±1.89)kg/m2,基礎FSH(7.32±0.57)IU/L,基礎LH(9.73±5.08)IU/L,內膜厚度(12.38±1.98)mm，獲卵數(10.62±1.98)個，4例患者種植成功，1例流產，3例活產。

3 討論

人類胚胎發育早期卵裂球多核是一種常見現象，約43.2%的胚胎在2細胞階段具有卵裂球多核現象[8]。因此胚胎卵裂早期卵裂球多核胚胎的發展潛力是目前的研究熱點[9]。研究發現，多核化與非整倍體和染色體異常率的增加之間存在相關性[10]。部分早期卵裂球多核的胚胎在發育的過程中能夠進行自我修復，減少多核帶來的不良影響，且多核胚胎有一半能發育到囊胚階段，超過20%的胚胎發育成形態學良好的囊胚[11]。而本研究結果顯示，B、C、D 組胚胎共培養292枚，其中第五天與第六天可利用囊胚共形成106枚，卵裂球多核胚胎囊胚可利用率達到36.30%，說明早期卵裂率球多核的胚胎具有一定的發育潛能，根據鼠胚染色體分離動力學研究[12]發現，早期胚胎分裂時紡錘體長度的變化可能在染色體分離中起著至關重要的作用，即在第1次有絲分裂時紡錘體長度明顯較第2次有絲分裂時短，染色體十分接近卵裂球中央位置，因此，胚胎完成第1次有絲分裂至2細胞階段時卵裂球多核現象的發生率明顯較高。本研究結果中，胚胎發育至2細胞階段多核率為48.93%，在胚胎繼續發育過程中4細胞階段卵裂球多核現象減少達到53.33%，同時相對于2細胞階段多核，4細胞階段多核胚胎在降低培養第3天優質胚胎率和培養第5天囊胚可利用率方面，差異具有統計學意義，表明大多數胚胎在早期卵裂分裂期間具有更強的自我校正能力，且4細胞期卵裂球多核對胚胎發育的影響更廣[11]。

本研究結果同時顯示在2細胞階段，僅含單個卵裂球多核的胚胎的培養第3天優質胚胎率和可利用囊胚率均高于雙卵裂球多核的胚胎，而Alikani等[14]發現在培養第2天胚胎中，未觀察到多核的卵裂期胚胎的囊胚形成率要高于含有1至2個卵裂球出現多核的胚胎，兩者階段不一樣，但都說明了隨著多核的增加，胚胎的囊胚形成率降低。

最新研究[15]還提示隨著胚胎內單核卵裂球的數目增多，胚胎的著床能力也會增加。除此之外，Hashimoto等[13]發現，如果胚胎第一次有絲分裂正常，其2細胞期出現的多核對胚胎的種植并不會產生影響，他們認為2細胞期多核并不應該成為胚胎移植刷選的排除因素，而4細胞期多核被認為是胚胎移植的排除標準。本研究最終僅統計到8例多核胚胎移植者，其中4例2細胞期單個卵裂球多核，發育至4細胞期無多核的胚胎移植后3例臨床妊娠，另有4例2細胞期卵裂球均多核，發育至4細胞期均無多核的胚胎移植后，4例臨床妊娠，其中1例流產。表明早期卵裂球多核的胚胎能夠產生妊娠，但是由于本次研究例數較少，無法進行統計學分析，在以后的研究中將一步擴大樣本數據進行分析。

綜上所述，2、4細胞卵裂球多核均可影響胚胎發育，且存在4細胞卵裂球多核的胚胎質量更低，早期卵裂球多核胚胎也可以用于胚胎移植。早期卵裂球多核是胚胎發育過程中常見的現象，且隨著多核卵裂球數量增加，對胚胎發育的影響越大。TLI技術能夠詳細觀察到卵裂球多核現象，將早期卵裂球多核與胚胎形態學參數相結合，可用來臨床挑選最優胚胎移植，來提高單胎活產率。