TLI篩選豬胚胎初次卵裂時間以預測早期胚胎發育

孫艷美，潘曉燕，曹詩雯，楊喆清，王立新

(吉林醫藥學院生殖醫學中心，吉林 吉林 132013)

隨著輔助生殖技術在臨床廣泛應用于治療不孕不育癥，一些母嬰并發癥的發生也越來越頻繁[1-2]。由于在一個試管嬰兒周期中通常會有幾個胚胎產生，我國一般移植≥2枚胚胎以保證妊娠結局，這就導致我國近30年來多胎妊娠率高達30%～40%[3]。為避免多胎妊娠，實施單胚胎移植(single embryo transfer,SET)是目前生殖醫學研究的重要方向，開展SET需要對發育周期內胚胎的發育狀態進行全面的評估，挑選最具發育潛能的胚胎進行移植。傳統的形態學評估無法全面評估胚胎發育潛能，缺少公認的量化指標，從而導致多胎妊娠等不良妊娠結局[4]。時差成像技術(time-lapse imaging，TLI)是非侵入性地評估胚胎在體外發育的手段，在臨床體外受精過程中引入時差成像技術，可以在整個培養期間對胚胎培養微環境進行無干擾的監測，跟蹤胚胎的發育過程，通過觀察胚胎形態動力學和動力學參數來選擇發育潛力最大的胚胎，有效的輔助單胚胎移植。

近年研究認為，受精胚胎早期卵裂是評估胚胎發育重要指標，有助于預測胚胎的發育潛能和植入能力[5-6]。由于豬與人具有相似的生理學特性，豬胚胎的體外生產已廣泛應用于為畜牧業生產以及生物醫學的研究，本研究以孤雌激活的豬胚胎為對象，通過TLI系統觀察胚胎早期卵裂的情況，探討初次卵裂時間對胚胎發育能力的影響，挑選出高質量的植入前胚胎，并闡明初次卵裂的影響機制，為臨床輔助生殖技中實施SET的可行性提供理論和機制基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

豬卵巢購自吉林市成祥屠宰場。

TCM-199、NaHCO3、NaCl、KCl、BSA、TBST、PBS、Hoechst33342、Tris均購自Sigma公司；HRP-Linked Antibody購自Abcam公司；SDS電泳液、ECL顯色液均購自碧云天生物技術研究公司。

1.2 卵丘-卵母細胞復合體收集及體外成熟培養

用注射器從卵巢表面抽取2～6 mm卵泡的卵母細胞，在立體顯微鏡下撿出2層以上卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes,COCs)用于成熟培養。將符合要求的COCs挑選出，放入150 μL TCM-199微滴中，在38.5 ℃、100%濕度和5% CO2培養箱內培養44 h。

1.3 成熟豬卵母細胞的孤雌激活及體外胚胎培養

在0.1%透明質酸酶中吹打除去卵母細胞周圍的顆粒細胞，在體視顯微鏡下挑選出具有第一極體的成熟卵母細胞，在5 μmol/L離子霉素中處理5 min后，在2.5 mmol/L二甲氨基嘌呤中孵育4 h，移到100 μL/滴的胚胎培養液中在38.5 ℃、100%濕度和5% CO2培養箱內培養。

1.4 Time-Lapse成像系統觀察胚胎發育

將胚胎移入Time-Lapse成像系統的培養盒中，利用Time-Lapse成像軟件連續拍攝胚胎的整個發育過程，確定其第一次卵裂的時間。有研究表明[7]豬卵母細胞孤雌激活后21 h已經開始了細胞的動力學變化，到48 h基本完成了二細胞分裂活動。以此為據，根據第一次卵裂速度的快慢將孤雌激活胚胎分為早期卵裂組(<24 h)、中期卵裂組(24～30 h)和晚期卵裂組(30～48 h)。胚胎分開培養并統計胚胎的桑葚胚率和囊胚率，以確定其對植入前胚胎發育率和發育質量的影響。

1.5 免疫熒光法檢測凋亡相關蛋白

分別收集早期卵裂、中期卵裂、晚期卵裂組培養至囊胚期的胚胎，用PBS洗5min，洗3遍后，封閉液室溫封閉1 h，然后分別用凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、P53的抗體4 ℃孵育過夜。第2天，棄去一抗孵育液，PBS洗3次，每次5 min。滴加熒光二抗避光濕盒中孵育1 h，每次5 min。滴加Hoechst33342避光染色5 min，PBS洗3次，每次5 min。封片液封片后共聚焦顯微鏡下立即觀察。

1.6 Western-blot檢測細胞周期蛋白

分別取早、中、晚期卵裂囊胚期胚胎，加入含1%PMSF的RIPA強裂解液提取蛋白。上樣，電泳，將電壓設置為80 V，約20 min樣品通過濃縮膠進入分離膠，將電壓調高到150 V，待溴酚蘭跑到膠底部時終止電泳。300 mA轉膜約45 min后，將轉移后的膜放入15%(W/V)脫脂奶粉(15 g脫脂奶粉，100 mL TBST)中，室溫搖床上緩慢搖動狀態下封閉1h，最后PVDF膜用細胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、細胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependent kinase1，Cdk)1、Cdk2的抗體孵育4 ℃過夜。次日，1×TBST室溫輕搖洗滌PVDF膜3次(每次10 min)，用HRP-抗體室溫孵育PVDF膜1 h。最后,將顯影液均勻覆在膜表面，Tanon 4600SF凝膠成像系統進行攝片。Image J軟件對圖片灰度值進行分析，最后對蛋白印跡結果作統計學分析。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 不同卵裂時間豬孤雌激活胚胎的桑葚胚率和囊胚率

孤雌激活，根據初次卵裂時間分為早、中、晚卵裂胚胎后，選出卵裂球形態均勻的2細胞胚胎進行體外培養，胚胎卵裂球大小均勻、透明帶完整，形態符合胚胎的發育階段被認為是正常發育的胚胎(圖1)。結果表明，同一批孤雌激活豬卵母細胞，24 h內發生初次卵裂的胚胎數明顯多于中期卵裂組和晚期卵裂組，早期卵裂組桑葚胚率、囊胚率明顯高于中期卵裂組(P<0.05)和晚期卵裂組(P<0.01)，中期卵裂組高于晚期卵裂組(表1)，但差異不明顯(P>0.05)。

表 1 早、中、晚期卵裂豬孤雌激活胚胎的桑椹胚率和囊胚率

2.2 不同卵裂時間對囊胚中凋亡相關基因表達的影響

分別收集每個組發育的囊胚，免疫熒光法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、P53的相對表達水平。結果顯示(圖2)，早期卵裂組囊胚中凋亡基因Bax、P53表達顯著低于中期和晚期卵裂組(P<0.01),而抗凋亡基因Bcl-2在早期卵裂組中的表達顯著高于中期和晚期卵裂組(P<0.01)，與中期和晚期卵裂組比較沒有差異。

2.3 不同卵裂時間對囊胚蛋白表達的影響

結果顯示(圖3)，早期卵裂組囊胚Cyclin B1、Cdk1和Cdk2蛋白的表達明顯高于中期和晚期卵裂組(P<0.05),中期與晚期相比差異不明顯。

3 討 論

體外繁殖技術(體外受精、體細胞核移植、孤雌生殖)中，人和牛的胚胎發育到囊胚的不到50%，豬胚胎體外囊胚發育率更低，只有20%～30%。與體內發育胚胎相比，體外繁殖技術胚胎的低發育率和胚胎質量低下是目前面臨的主要挑戰，著床前階段的胚胎衰竭是在全世界范圍內導致農業和科研生殖率低下的一個重要原因[8]。如何安全有效地篩選出最具發育潛能的胚胎是開展體外繁殖技術研究的重要方向。研究顯示早期卵裂作為胚胎發育過程的重要環節，在預定時間段內發生卵裂的胚胎，其染色體異常率低,種植能力高，胚胎具有較高發育潛能和較好的種植能力，可以獲得較好的妊娠結局[9],這些研究多集中在人和小鼠上，而且缺乏具體的機制研究。本研究以孤雌激活豬卵母細胞為研究對象，分析了早期卵裂、中期卵裂和晚期卵裂胚胎之間發育潛能的差異，發現相對早期發生卵裂的胚胎在體外培養過程中桑椹胚率和囊賠率更高,這一發現與以往早期卵裂與豬體細胞核移植胚胎發育相關性的研究相一致[10]。

通過對各組囊胚凋亡相關基因Bcl-2、Bax、P53進行檢測發現，在早期卵裂組凋亡相關基因Bax、P53的表達水平顯著低于中期和晚期卵裂組，而抗凋亡因子Bcl-2的表達更高，這表明早期卵裂組胚胎凋亡減少，胚胎的發育能力較高。Cyclin B1和Cdk作為細胞周期的重要調節因子參與細胞周期的調節，胚胎發育過程中必需Cyclin B1的參與，而胚胎早期分裂Cdk發揮重要的作用。在胚胎發育過程中Cyclin B1從細胞核轉移到質膜上形成CyclinB1-Cdk1，以阻止細胞進行有絲分裂而過早成熟。在Cyclin B1缺失的情況下，DNA復制后細胞停滯在G2期的四細胞期[11]。在發育不全的卵母細胞和胚胎中，母體細胞Cyclin B1和Cdk2表達水平均降低[12]。通過抑制Cdk 2活性能夠誘導胚胎DNA損傷，胚胎表現出延遲分裂并在囊胚期之前停止發育，所以Cdk 2通過直接或間接影響DNA修復相關基因的表達而發揮作用[13]。本研究結果表明，豬孤雌激活早期卵裂的胚胎囊胚中Cyclin B1、Cdk1 、Cdk2的表達水平更好，促使胚胎進入正常的有絲分裂，促進胚胎分裂和囊胚的形成，改善豬胚胎的早期發育。

胚胎發育過程是個復雜的、不斷變換的過程，應用TLI觀察胚胎的早期卵裂情況，確定早期卵裂的時間具有重要的意義。本次研究發現，孤雌激活豬卵母細胞初次卵裂較早的胚胎其發育潛能的更好，胚胎的桑椹胚率和囊胚率更高，能為輔助生殖技術選擇單個優質囊胚提供依據，但對于臨床妊娠結局的影響還有待于進一步研究。