CHE生物飼料發酵過程中活性酵母變化規律的研究

黃 亮 童應凱 任 健 陳仁紹

隨著畜牧業的快速發展，抗生素等藥品的大量使用，飼料安全、食品安全問題已成為養豬生產者和消費者關注的焦點。發酵飼料能有效地抑制消化道中大腸桿菌、沙門氏菌及一些致病性細菌與病原體的繁殖與生長，對豬疾病的防御有一定的功效，提高生豬產品的食品安全性[2]等。因此，世界各國近年來對豬發酵飼料特別重視，發酵飼料在我國也得到了較好的發展[1]。

CHE飼料的固態發酵過程是一個微生態發酵的過程，固態發酵中多個菌種之間可互相補償其缺陷，進行協同互生發酵[3]。目前用于固體發酵飼料的微生物，常見的有酵母菌、霉菌、芽孢桿菌和乳酸菌等。

本實驗通過對CHE生物飼料發酵過程中，測得的酵母活菌數和還原糖及粗蛋白的含量變化曲線可以更直觀地把握菌種的生長與分解基質情況，結合各類菌在發酵過程中的作用，可以人為地提高特定階段有利微生物數量，使基質的發酵向最有利的方向進行，最終為獲得優質高效的微生態生物飼料——CHE打下扎實的基礎，為我國生態農業的快速發展，生產無公害綠色肉、禽、蛋、奶打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

天津市祥華生物飼料有限公司CHE飼料樣品（每6 h取1次）。

1.1.2 培養基

YEPD培養基：蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%、瓊脂2%、pH值6.0。

察氏培養基：NaNO30.3%、KCl 0.05%、K2HPO40.1%、FeSO40.001%、MgSO4·7H2O 0.05%、瓊脂 2%，pH值6.7。

1.2 方法

1.2.1 活菌數測定

選用對應的培養基進行微生物培養，具體方法參照杜連祥等[4]微生物試驗技術試驗，使用涂布平板法進行培養計數，檢驗程序見圖1。

圖1 菌落總數檢驗程序

1.2.2 還原糖含量的測定

使用3,5－二硝基水楊酸比色法對樣品中的還原糖含量進行測定[9]。從標準曲線上查出樣品的A540值對應的還原糖c（mg/ml），然后按下式計算樣品中還原糖的含量。

還原糖含量(%)=c×樣品稀釋總體積（ml）×10－3/樣品質量。

2 結果與分析

2.1 還原糖含量的測定結果及分析

2.1.1 葡萄糖標準曲線(見圖2)

圖2 葡萄糖含量標準曲線

2.1.2 發酵中還原糖含量的變化(見表1)

從表1可以看出，隨著發酵的進行，發酵溫度在不斷地升高，中間出現微小的波動，可能的原因是翻堆使料溫降低。第一次翻堆：從起始溫度16～48℃，經歷了66 h后，進行了第一次翻堆，翻堆后，發酵溫度經歷短暫的平穩期后，繼續升高；隨著發酵的進行，經歷84 h后，發酵溫度升至55℃，進行第二次翻堆，距離第一次翻堆24 h。6 h后，溫度降至50℃，這可能是因為進行了第二次翻堆。之后，發酵溫度繼續升高；經歷108 h后，發酵溫度升至58℃，進行第三次翻堆，距離第二次翻堆24 h。6 h后，溫度降至55℃之后，料溫再次升高；120 h后，發酵溫度再次升至58℃，進行第四次翻堆，距離第三次翻堆12 h。之后，料溫呈下降的趨勢，直至50℃，發酵結束，采用低溫烘干箱烘干。CHE飼料固態發酵中，在微生物作用下，能使原料從起始的16℃升至58℃高溫。

表1 CHE飼料發酵溫度及還原糖含量的監測

CHE飼料發酵中還原糖含量在3.21%～4.88%上下波動，可能是因為在微生物及其產生的各類活性水解酶的作用下，促使高分子化合物淀粉、纖維素等分解為單糖，同時微生物的生長也需要消耗部分所產生的還原糖，所以呈現出此消彼長的趨勢，但其能在保證大量的活性益生菌的生長時，保持3.21%的還原糖含量。

當發酵時間達到78 h后，CHE飼料中還原糖的含量呈下降的趨勢，并最終穩定在3.32%。這基本保證了發酵結束后CHE飼料成品中含有豐富的營養（速效能源）及活性益生菌生長所需的碳源。

將CHE－飼料發酵過程中溫度的變化與還原糖的含量變化曲線(取 1、4、8、12、16 和 23 號樣品)進行比較分析，見圖3。

從圖3可以看出，在發酵前中期（0～114 h）還原糖含量的變化與發酵溫度無明顯相關，但在114 h，發酵溫度達到52℃后，還原糖呈下降的趨勢，這可能是因為高溫影響了水解酶的活性或酵母菌的生長。

圖3 發酵溫度與還原糖含量變化曲線比較

2.2 發酵過程中活性菌的生長情況

使用涂布平板法，分別對樣品 1、4、8、12、16、20和23號等7個樣品進行了活菌數測定，培養溫度為28℃，培養時間為2～4 d，測定結果以取樣時間為橫坐標，酵母菌活菌落數為縱坐標，并將縱坐標的刻度設為對數刻度后，見圖4。

圖4 酵母活菌數與發酵溫度變化曲線分析

從圖4可以看出，16～28℃時，隨著發酵溫度的升高，酵母菌的數量隨著溫度和時間同步增加，處于菌量積累期；當發酵溫度高于28℃后，直至50℃，酵母菌的生長處于下滑期，這可能是因為不耐高溫的酵母菌種類慢慢被淘汰；之后，從50～55℃時，酵母菌群得到快速生長，可能的原因是經高溫淘汰，剩余的耐高溫的優勢酵母菌群得到繁殖和生長，在55℃達到最大生長值。隨后，發酵溫度降至50℃，離開了耐高溫的優勢酵母菌群的最適生長溫度，生長受抑制，生長曲線呈下降趨勢，但降幅不大，因為已經積累了相當多數量的菌群。

在菌落計數過程中，通過形態學觀察，發現不同階段的樣品在YEPD平板上，均長有常見的釀酒酵母、產朊假絲酵母等。

3 討論

CHE生物飼料是祥華公司與天津農學院經過幾年的合作，于2005年成功研發的。CHE生物飼料是以富含酵母菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌等有益微生物的益生素為主要原料，添加低聚糖、消化酶、豆粕、玉米蛋白粉、鈣、磷等有益活性物，經微生態發酵和低溫干燥新工藝，在大量有益微生物作用下，生產出來的集植物蛋白、菌體蛋白與復合酶于一體的生物飼料。

CHE飼料中積累了大量的酵母菌，能為牲畜提供優質的菌體蛋白、維生素、營養素、風味物質、芳香類化合物和代謝化合物等，活性酵母能產生促進細胞分裂的生物活性物質有強化營養和抗病促長的效果[1－2]。

4 結論

①CHE飼料發酵過程中溫度會隨著時間的增加而升高，最高可達58℃；經過4次翻堆后，可以使發酵的溫度控制在58℃以下，并使發酵結束后的料溫控制在50℃左右。

②CHE飼料發酵過程中，酵母菌得到了快速的繁殖，在發酵的后期，維持50～55℃的溫度，有利于酵母菌的積累?？赏ㄟ^增加發酵后期（50～55℃）的翻堆的次數，使發酵溫度控制在50～55℃。一方面，能促進酵母菌活菌數量的快速積累；另一方面，能保證在發酵后期還原糖含量的穩定，滿足微生物的生長，及CHE飼料成品中還原糖的含量。

③在采集的CHE飼料樣品中，未見霉菌生長（結果未列出）。但CHE飼料發酵過程中還原糖的含量基本維持在3.21%以上，最大值高達4.88%，考慮到霉菌產生的活性酶能水解CHE飼料發酵基質中淀粉、纖維素等高分子化合物，后期優化可在發酵環節中增加霉菌的添加量，以進一步提高飼料的營養價值。

[1]鄒志恒,宋瓊莉,韋啟鵝,等.發酵飼料在養豬生產中的應用與研究進展[J].中國動物保健,2009(3):66－68.

[2]陸文清,胡起源.微生物發酵飼料的生產與應用[J].飼料與畜牧，2008,7:5－9.

[3]張長霞.混菌固態發酵蘋果渣生產蛋白飼料的研究[D].天津科技大學,2004.

[4]杜連祥，路福平.微生物學試驗技術[M].北京:中國輕工業出版社,2008.

[5]張常書.生態型低成本高效益養殖技術[J].湖南飼料,2000(1):15－18,29－30.

[6]陳敏.發酵稻草主產飼料蛋白優良菌種的篩選[J].飼料研究，1999(9):32－34.