抗菌肽CecropinAD在畢赤酵母中的組成型表達及中試發酵研究

江學斌 張敏靜 林健聰 梁世中

抗菌肽（antibacterial peptide）是一類在一定誘導條件下，由宿主細胞特定編碼基因產生的對抗外源性病原微生物的小分子肽類活性物質。經研究表明，抗菌肽具有分子量小、穩定性好、無免疫原性等特點，具有廣譜的抗菌、抗病毒作用，在生物體的自然免疫中具有重要的防御和保護作用。天蠶素 (Cecropins)是由Boman等[1]從惜古比天蠶蛹中誘導分離獲得，由37～39個氨基酸組成，相對分子質量約4000 Da，包括Cecropin A、Cecropin B、Cecropin C、Cecropin D 等，是目前研究背景最為清晰、作用效果較好的一類抗菌肽。而抗菌肽Cecropin AD（CAD）是由cecropin A的N端1～11肽段和cecropin D的C端12～37肽段組成的雜合肽，呈線性陽離子α螺旋構型，其殺菌活性和抗菌譜明顯優于cecropin A和cecropin D[2]，具有無殘留毒性和病原體難以產生耐藥性的優點，應用前景廣闊。

抗菌肽被認為是目前最有發展前景的天然多肽抗生素和綠色飼料添加劑。與傳統抗生素相比，抗菌肽不僅具有廣譜的抗菌活性，穩定性高，而且不易導致耐藥性菌株產生[3]。而抗生素作為飼料添加劑使用容易破壞動物胃腸道微生物平衡，在動物體內殘留，嚴重影響產品質量；同時，濫用抗生素易產生多耐藥性菌株，從而導致難以控制的大面積動物疫情。多項實驗結果表明，抗菌肽可提高動物抗病能力，促進動物生長[4－7]，而且不容易產生耐藥性，具有替代傳統飼用抗生素的潛能。然而，由于抗菌肽在生物體內含量極少，難以大量提取獲得；而其分子量小，對表達宿主具有抑制和殺傷作用，因此，抗菌肽的規?；a仍是目前限制抗菌肽應用的首要瓶頸。

本研究采用基因工程技術，在畢赤酵母中通過組成型分泌到胞外的方式表達抗菌肽Cecropin AD，并進行抗菌肽Cecropin AD組成型表達的50 L發酵罐規模中試研究，研究其體外抗菌活性和抗菌譜，為抗菌肽的規?；a和應用提供前期基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒

酵母表達菌株Pichia pastoris X－33、含抗菌肽CAD基因片段的質粒pUC－CAD、真核表達質粒pGAPZα－A、大腸桿菌ATCC25922、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌 ATCC25923、金黃色葡萄球菌 MRSA 5636、枯草桿菌、綠膿桿菌ATCC27853等均由廣州大學生物工程研究所保存。

1.1.2 工具酶和試劑

限制性內切酶Xba I、Xho I和Sca I，質粒小量提取試劑盒、T4DNA連接酶、DNA膠回收試劑盒、DNA聚合酶、Zeocin等購自中國大連寶生物工程有限公司；PCR引物由廣州英濰捷基公司生物技術有限公司合成。其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體的構建

根據抗菌肽CAD基因序列，設計并合成兩條上下游特異性引物（見表1）。以pUC－CAD為模板，利用PCR擴增的方法獲得編碼抗菌肽CAD的DNA片段，該片段的兩端分別含有Xho I和Xba I酶切位點。PCR擴增得到的基因片段經限制性內切酶雙酶切后連接到pGAPZα－A上，構建表達質粒pGAPZαA－CAD并轉化大腸桿菌DH5α，Zeocin抗性篩選重組轉化子并送廣州英濰捷基公司生物技術有限公司進行DNA序列測定。

表1 擴增目的基因PCR引物

1.2.2 重組質粒對酵母宿主菌X33的轉化

制備畢赤酵母菌株X33的感受態細胞，取80 μl與10 μg Avr II單酶切線性化的重組表達質粒pGAPZα－A－CAD混勻，進行電擊轉化（25 μF，1500 V），29 ℃溫育1 h后，將菌液涂在含有100 μg/ml Zeocin抗生素的YPD固體培養基平板上，29℃恒溫培養2～4 d，篩選出陽性菌落。同時，將Avr II線性化的pGAPZα－A空質粒轉化酵母，制備的pGAPZα－A轉化X33菌株作為空白對照。挑取平板上的轉化子，振蕩培養過夜，離心收集菌體進行PCR鑒定，以X33/pGAPZα－A培養上清為陰性對照，篩選出整合有目的基因的重組子。

1.2.3 重組抗菌肽Cecropin AD的表達

將PCR鑒定得到的陽性重組酵母轉化子X33/pGAPZαA－CAD分別接種到10 ml YPD培養基中29℃，250 r/min振蕩培養96 h后，離心收集培養上清。以 X33/pGAPZα－A 培養上清為對照，Tricine－SDSPAGE檢測培養上清中重組蛋白的分泌表達情況。

1.2.4 重組抗菌肽Cecropin AD的初步抗菌活性測定

采用瓊脂孔穴擴散法，以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為實驗菌株，將金黃色葡萄球菌懸浮液（OD600=0.5～0.6）50 μl與 46 ℃的 LB 固體培養基 100 ml混勻后鋪平板，待其凝固后4℃保存，用無菌打孔器（直徑8 mm）打孔，每孔中滴加經100℃加熱處理10 min的待測培養上清100 μl，待孔中液體被培養基吸收完全后，上述平板37℃倒置培養過夜（10～12 h）。以同體積的X33/pGAPZα－A培養上清為陰性對照，氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）為陽性對照，第2 d測量抑菌直徑，抑菌圈直徑(mm)=測量直徑－孔徑(即8 mm)。

1.2.5 抗菌肽Cecropin AD的中試發酵

一級種子：上述篩選得到的抗菌活性最強的重組菌株甘油菌種，取0.5 ml接入含YPD培養基20 ml的100 ml錐形瓶中，29℃、250 r/min培養10 h；二級種子：按5%的接種量接入含YPD培養基250 ml的1 L錐形瓶中，同樣條件下培養10 h；三級種子：按10%的接種量接入含有YPD培養基3 L的5 L發酵罐，同樣條件下培養約10 h。

50 L罐發酵：培養在50 L發酵罐中進行，發酵罐基礎培養基為30 L的YPD培養基，接種前校正pH值電極和溶氧電極，培養過程中保持通氣量大于60 L/min，發酵過程中菌體利用葡萄糖產酸，用KOH溶液調節pH值5.5，培養溫度設定為29.0℃，起始轉速為150 r/min，隨著菌體的生長不斷提高轉速，發酵過程中控制溶氧大于30%，培養48 h后放罐。每2 h取少量發酵液，測定其菌體濕重、葡萄糖含量以及抑菌活性。轉速、溫度、pH值和溶氧等參數由發酵罐自動檢測，記錄數據。

1.2.6 抗菌肽Cecropin AD的中試發酵產物抗菌活性測定

參照1.2.4節的方法，以同體積的X33/pGAPZα－A培養上清為陰性對照，氨芐青霉素為陽性對照，測定抗菌肽Cecropin AD的中試發酵產物對大腸桿菌ATCC25922、大腸桿菌 DH5α、金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌 MRSA 5636、枯草桿菌、綠膿桿菌ATCC27853的抗菌活性。

2 結果

2.1 重組克隆載體的構建與鑒定

以pUC－CAD為模板，利用上下游特異性引物F和R，通過PCR方法獲得編碼抗菌肽CAD蛋白的DNA片段。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在120 bps附近得到目的條帶，與預期大小相符（見圖1）。PCR擴增得到的基因片段經限制性內切酶（Xho I和Xba I）雙酶切后連接到pGAPZα－A上，轉化大腸桿菌DH5α，Zeocin抗性篩選重組轉化子并送廣州英濰捷基公司生物技術有限公司進行DNA序列測定，測序結果顯示，所得到編碼重組蛋白CAD的DNA序列與預期一致（資料未顯示）。

挑取抗性平板上的轉化子，29℃、250 r/min，振蕩培養過夜，離心收集菌體進行PCR鑒定，結果見圖2，所挑取重組子均呈PCR陽性。

圖1 PCR擴增產物

圖2 PCR篩選重組酵母

2.2 重組抗菌肽Cecropin AD的表達和初步活性測定

挑取上述PCR鑒定呈陽性的重組轉化子分別接種到10 ml YPD培養基中29℃，250 r/min振蕩培養96 h后，離心收集上清。培養上清的Tricine－SDS－PAGE檢測結果表明，與X33/pGAPZα－A培養上清相比，重組子培養上清在4.0kDa處均有一明顯的蛋白條帶 (見圖3)，與抗菌肽Cecropin AD的理論分子一致。瓊脂孔穴擴散法測定重組子抗菌活性結果也顯示 (見圖4)，經加熱處理的重組子培養上清對金黃色葡萄球菌ATCC25923具有顯著抑制作用，而同樣處理的對照菌株X33/pGAPZα－A的培養上清則未見明顯抑菌圈。

2.3 重組抗菌肽Cecropin AD的中試發酵

經Tricine－SDS－PAGE和瓊脂孔穴擴散法篩選得到工程菌X－33/pGAPZαA－CAD，通過種子活化和三級種子擴增后，轉入50 L發酵罐進行中試發酵研究。如圖5所示，工程菌Pichia pastoris X－33/pGAPZαA－CAD接種后 0～8 h，菌體濕重（wet weight）緩慢增加，處于適應期，8 h后，菌體開始快速生長進入指數生長期，利用葡萄糖產酸導致pH值下降，緩慢流加KOH維持pH值在5.5左右。至發酵12 h時，發酵液開始檢測到抗菌活性，隨著發酵時間的延長，抗菌活性增強，42 h后，抗菌肽CAD的表達開始進入平臺期，抗菌活性增長緩慢，至48 h，抗菌活性達到最大，停止發酵，收獲培養上清。

圖3 重組抗菌肽Cecropin AD表達產物的Tricine－SDS－PAGE 分析

圖4 重組抗菌肽Cecropin AD表達產物的抗菌活性測定

瓊脂孔穴擴散法試驗結果也顯示 (見圖6)，36和48 h發酵液上清經100℃加熱處理10 min后對金黃色葡萄球菌ATCC25923均有明顯的抑殺作用；但100 μl培養48 h的發酵液上清對金黃色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌圈直徑(減去孔徑8 mm)可達17.8 mm，抑菌活性明顯優于2 μg的陽性對照Amp(11.5 mm)。

圖5 Pichia pastoris X－33/pGAPZαA－CAD 發酵的菌重與抑菌活性的變化

圖6 重組抗菌肽Cecropin AD發酵液的抑菌活性

2.4 重組抗菌肽Cecropin AD中試發酵產物的抗菌活性檢測

50L發酵收獲的上清，經100℃加熱處理10 min后，分別取100 μl檢測發酵上清對大腸桿菌ATCC25922、大腸桿菌DH5α、金黃色葡萄球菌 ATCC25923、金黃色葡萄球菌 MRSA 5636、枯草桿菌、綠膿桿菌的抗菌活性，結果見表2，重組抗菌肽Cecropin AD發酵上清對供試菌的敏感程度依次為：枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌 ATCC 25922＞大腸桿菌DH5α、耐藥性金黃色葡萄球菌 MRSA 5636＞綠膿桿菌ATCC27853。

3 討論

近年來，濫用抗生素導致耐藥細菌產生的問題不斷加劇，超級細菌的出現更使人們重新審視抗生素的定位和作用。越來越多的國家對抗生素在農產品中的添加予以限制和禁止，因此，迫切需要開發能夠取代傳統抗生素的新型添加劑?？咕木哂袩岱€定性好、抗菌譜廣、殺菌快、無耐藥性及毒副作用等特點，并且與傳統抗生素共同使用有增效作用，已成為人們關注的熱點。在農業養殖方面試驗結果顯示，抗菌肽作為飼料添加劑，在肉雞、乳豬和對蝦方面已經獲得了很好的成效[5-7]，不僅可以抗病，還可以增強動物機體的免疫力，提高肉料比，均顯示了抗菌肽具有替代傳統抗生素的潛能。

表2 重組抗菌肽Cecropin AD中試發酵產物的抗菌譜

隨著抗生素在農產品生產中的限制和禁止，必將導致行業對抗菌肽的需求不斷上漲，但從生物體中提取抗菌肽的含量太少，難度大，而化學合成成本高等限制因素，已成為抗菌肽開發應用的一個瓶頸。而通過基因工程技術生產抗菌肽則具有成本低廉、產量大的優點，有望實現抗菌肽的規?；a。畢赤酵母表達系統是優秀的真核表達系統，已有多種外源蛋白在酵母表達系統中成功表達并得以應用[8-10]。它具有完備的基因表達調控機制、蛋白質加工修飾[11]及分泌能力，而且不會產生內毒素。本研究基于抗菌肽CecropinAD穩定性良好的前提，通過畢赤酵母表達系統組成型表達抗菌肽Cecropin AD，通過信號肽將其分泌到細胞外，并進行了50 L發酵罐的中試研究，此方法獲得的抗菌肽作為飼料添加劑，方便快捷，不會因內毒素而導致動物機體中毒和腹瀉，同時，組成型區別于甲醇誘導型的酵母表達方式，培養簡單，無需更換碳源，也可以避免揮發性的毒性物質甲醇污染動物機體和環境。

4 結語

本試驗對重組抗菌肽CecropinAD進行了50 L規模的發酵中試研究，結果表明，菌體濕重到了后期增長緩慢，其主要原因是抗菌肽在組成型表達的過程中，隨著Cecropin AD濃度不斷上升，其表現出對酵母宿主菌的毒性作用，當表達的抗菌肽CecropinAD達到了一定的濃度后，宿主菌停止生長，抗菌肽表達進入平臺期后結束發酵。該發酵周期短，培養簡單方便，節省成本。后期工作重心在于提高抗菌肽Cecropin AD基因工程菌的生物量及其表達量，優化發酵培養基的碳氮源配置，更大程度地降低生產成本，為日后的規?；a和應用打下堅實的基礎。

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