黃連素預處理對家兔心肌缺血再灌注損傷的抗氧化保護作用

于永燕，于 丁

（1.河東社區衛生服務中心，河北 石家莊 050000；2.河北醫科大學第二醫院，河北 石家莊 050000）

急性心肌梗死最有效的治療是有效恢復缺血心肌的血液灌注，近年來，再灌注治療包括溶栓治療和經皮冠狀動脈介入治療等取得很大進展，已成為急性心肌梗死治療的有效手段。然而，大量研究證實，心肌缺血再灌注同時可能帶來心肌再灌注損傷，后者可能抵消早期再灌注所帶來的益處甚至加重心肌損害。氧自由基是造成缺血再灌注損傷的直接原因[1]。黃連素是毛莨科植物黃連干燥根莖的提取物之一，近年發現其對心血管系統有明顯作用，但其對家兔心肌缺血再灌注損傷的作用少見報道[2]。本實驗研究黃連素對家兔在體心肌缺血再灌注損傷的作用，并探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1 材料

（1）動物：新西蘭大白兔，由河北醫科大學實驗動物中心提供，雌雄不限，體質量（2.0±0.2）kg。（2）藥品和試劑：黃連素購自J&K化學公司；戊巴比妥鈉購自美國sigma公司；肌酸磷酸激酶（CPK）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、NO（一氧化氮）試劑盒、NOS（一氧化氮合酶）試劑盒和考馬斯亮蘭試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物模型的建立及實驗分組

1.2.1 動物模型的建立 動物選用新西蘭大白兔，用戊巴比妥鈉30 mg/kg從兔耳緣靜脈注入進行麻醉，采用背位固定于手術臺上，分離氣管并插管，剪去胸部毛，酒精消毒，沿胸骨正中線行胸正中切口，剝去胸肌，找到3～4肋骨，進入胸腔，用開胸器撐開切口，暴露心臟，用止血鉗輕輕提起左心耳，在左心耳根部下方約3 mm進針，穿絲線縫扎冠狀動脈左前降支，40 min后打開結扎線使冠脈灌流再通2 h[3]。

1.2.2 實驗分組 新西蘭大白兔35只，隨機分組，每組7只，共分5組：（1）假手術組：只繞冠狀動脈左旋支穿線，不結扎，給予水。測梗死范圍時不設假手術組。（2）缺血再灌注組：結扎冠狀動脈左旋支40 min后，剪開結扎線，再灌注2 h。（3）黃連素小劑量組3 mg/kg。（4）黃連素中劑量組6 mg/kg。（5）黃連素大劑量組12 mg/kg，灌胃給藥，用藥體積均為1 mL/ kg，每日給藥1次，術前給藥1周。

1.3 指標測定

1.3.1 家兔血漿CPK、SOD活性和MDA含量測定 在實驗結束后立即從家兔左頸總動脈取血，并用肝素抗凝，然后3 000 r/min 離心15 min，取上清液，按試劑盒步驟要求測CPK、SOD活性和MDA含量。

1.3.2 心肌組織中NO含量和NOS活性測定 取血后迅速剪取家兔心臟，用4℃生理鹽水沖凈血液后，取結扎點以下梗死心肌組織，加入0.1 mol/L PBS，冰浴下制成心肌組織勻漿，3 000 r/min 離心15 min，取上清液按試劑盒要求步驟測量NO含量和NOS活性。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 黃連素對缺血再灌注家兔血漿CPK、SOD活性和MDA含量的影響（見表1）

表1 黃連素對缺血再灌注損傷后血漿MDA含量和SOD、CPK活性的影響

如表1所示，與假手術組比較，模型組MDA含量和CPK活性的明顯增加，SOD的活性明顯降低。黃連素組與模型比較，血漿MDA含量和CPK活性降低，SOD的活性明顯增加。

2.2 黃連素對缺血再灌注家兔心肌組織NO含量和NOS活性的影響（見表2）

表2 黃連素對缺血再灌注損傷后心肌組織NO含量和NOS活性的影響（，n=7）

表2 黃連素對缺血再灌注損傷后心肌組織NO含量和NOS活性的影響（，n=7）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 NO（μmol/g） T-NOS（U/mg） i-NOS（U/mg）假手術組 47.32±11.21 0.72±0.23 0.37±0.07模型組 25.15±5.97** 0.46±0.09** 0.30±0.08黃連素小劑量組 27.31±6.21 0.49±0.12 0.34±0.05黃連素中劑量組 30.18±6.16 0.53±0.13 0.36±0.06黃連素大劑量組 35.27±7.12# 0.58±0.11# 0.35±0.07##

如表2所示，與假手術組比較，模型組心肌組織NO的含量和T-NOS的活性明顯降低。黃連素組與模型組比較，心肌組織NO含量和T-NOS的活性增加，iNOS活性各組間無明顯差別。

3 討論

隨著冠狀動脈內溶栓、冠狀動脈旁路移植術、經皮穿刺冠狀動脈腔內成形術、激光冠狀動脈再通術等在臨床上的廣泛應用，心肌缺血再灌注損傷越來越受到心血管病醫生的重視。它是指在缺血再灌注后心肌損傷反而進一步加重并引起細胞死亡。缺血再灌注后心肌酶釋放多少是反映心肌損害程度的重要指標，心肌酶CPK等存在于心肌細胞漿內，當心肌細胞受損時溢出會增多，CPK溢出越多，血漿中活性越高。在實驗中，缺血再灌注組CPK含量較假手術組組明顯增高，說明缺血再灌注時心肌細胞損傷嚴重[4,5]。在實驗中，我們可以看到，黃連素可減低心肌缺血再灌注后CPK含量，提示黃連素可保護心肌細胞。

缺血再灌注損傷可能與再灌注時生成大量氧自由基和鈣超載或鈣再分布等有關。超氧化物歧化酶（SOD）是體內清除自由基的一類主要的酶，其活性降低可引起氧自由基的積聚，從而使細胞及亞細胞的膜發生脂質過氧化反應，引起脂質代謝產物丙二醛（MDA）水平升高，丙二醛的增多可引起DNA、蛋白質發生交聯造成細胞損傷，是心肌缺血再灌注損傷的重要機制之一。因此，SOD 和MDA 的水平可反映氧化應激反應程度的指標，也反映了機體清除氧自由基的能力[6-8]。在實驗中，模型組缺血再灌注后，MDA含量明顯增高，SOD活性降低，說明心肌缺血再灌注后，產生大量的氧自由基，介導了細胞膜的脂質過氧化反應，消耗了SOD，我們檢測了黃連素對缺血再灌注后血漿SOD和MDA的影響，結果顯示，黃連素可降低MDA含量，升高SOD活性。這些結果均揭示黃連素可增強機體清除氧自由基的能力，減輕細胞膜脂質過氧化損傷，從而發揮保護作用。

NO含量升高可引起冠脈擴張，冠狀血流增加，另外NO也發揮抗氧化作用，使內皮細胞免受氧自由基的損傷，維持內皮細胞的完整性，進而減少中性粒細胞的粘附。NOS是NO合成的限速酶，和缺血再灌注損傷關系比較密切的NOS有iNOS（誘導型）、和eNOS（內皮細胞型NOS）[9]。本試驗中，在缺血再灌注損傷后可檢測到心肌組織NO的含量和T-NOS活性的降低，黃連素則可提高缺血再灌注損傷后心肌組織NO的含量和T-NOS的活性，從而發揮對兔心肌缺血灌注損傷的保護作用。但對iNOS影響并不大，因此，本實驗中，黃連素升高NO的含量可能主要與升高eNOS活性有關。

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