補益營衛對衰老小鼠皮膚組織bFGF表達的影響

周小平，馬艷紅，傅延齡

（1.寧夏醫科大學中醫學院，銀川 750004；2.北京中醫藥大學，北京 100029）

營衛具有“熏膚、充身、澤毛、溫分肉、充皮膚、肥腠理、司開合”的作用，與皮膚生理病理有十分密切的關系。營衛的盛衰是影響皮膚狀態的重要因素，因此研究營衛與皮膚衰老間的關系具有理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 動物

健康4月齡昆明種小鼠120只，清潔級，雌雄兼用，購自北京大學醫學部實驗動物中心。各組小鼠在相同條件下自由攝食、飲水，保持自然光照。

1.2 藥物

補益營衛藥物由人參、甘草等組成，藥物購自本校國醫堂，為同仁堂優質飲片。由本校藥學系中藥制備教研室加工、濃縮成4g/ml（每毫升含4g生藥）的浸膏，避光4℃冷藏備用，灌胃時用生理鹽水配成所需濃度。設維生素E為陽性對照藥，購自市售藥店。

1.3 造模及給藥方法

1.3.1 分組造模 把120只4月齡昆明種小鼠雌雄分開，每性別小鼠體質量均衡隨機各分為6組，每組10只，分別設為正常組、模型組、陽性對照組、補益營衛高劑量組、中劑量組和低劑量組。正常組常規進食飲水及光照。其他各組參照文獻法［1］按120mg/kg體質量每日背部皮下注射 D-半乳糖，每周禁食稱重1次。

1.3.2 給藥 造模同時模型組每日灌服生理鹽水，陽性對照組每日灌服維生素 E 50mg/kg，補益營衛高、中、低劑量組按（生藥/體質量）8g/kg、4g/kg、2g/kg灌胃，連續 6 周。

1.4 取材方法

第7周處死動物前1d，動物用10％硫化鈉溶液脫去兩肩胛至兩髂骨之間背部皮膚的毛，第2天用10％水合氯醛按3.5ml/kg體質量腹腔注射麻醉，腹主動脈取全血放入肝素鈉管中，低溫離心機3500rpm，離心20min取上清冷藏待測。分離血清后的紅細胞沉淀用0.9％生理鹽水3500rpm，離心洗滌2次，－80℃凍存待測。剪下背部脫毛皮膚鋪平，用直徑1.4cm的打孔器取下兩塊皮膚，除去皮下組織適當剪碎，先用電動勻漿機勻漿，顯微鏡下觀察，勻漿不充分者再用手動使勻漿充分，濃度為10％，勻漿過程均須在冰水中進行。取材時剪取頸部皮膚，置4％中性多聚甲醛溶液中固定，1周后換溶液1次。24h后常規組織脫水、透明、浸蠟和包埋。

1.5 主要儀器

AE160型電子分析天平，DDL-5型低溫離心機，Bio-RAD680酶標比色儀，全自動石蠟切片機，Olympus光學顯微鏡，臺式水浴恒溫振蕩器SHZ-88等。

1.6 主要試劑

多聚甲醛、無水乙醇等分析純購自北京化學試劑公司。兔抗鼠 bFGF多克隆抗體、黃色 DAB顯色劑、山羊抗兔 IgG-抗體-HRP多聚體、牛血清白蛋白（BSA）均購自北京中山金橋生物工程有限公司。復合消化液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.7 免疫組織化學法檢測bFGF的表達

5μm石蠟切片脫臘、水化，3％H2O2室溫孵育10min，PBS洗 3min ×3，去離子水洗 2min，3％H2O2室溫孵育 10min，0.01M PBS洗 3次，每次 3min，滴加復合消化酶，37℃ 修復 20min，0.01M PBS洗 3次，每次3min，牛血清白蛋白室溫封閉 20min傾棄，滴加 1∶100兔抗鼠 bFGF多克隆抗體，4℃過夜，0.01M PBS洗 3次，每次 5min，滴加山羊抗兔 IgG-抗體-HRP多聚體，37℃30min，0.01M PBS洗 3次，每次5min，滴加黃色 DAB室溫顯色5min，去離子水洗中止反應，脫水、透明、中性樹膠封片。每組染色均設以PBS液代替一抗的陰性對照。必要時去離子水洗中止反應后蘇木素襯染，脫水、透明、中性樹膠封片。

通過安裝在 B×51正置熒光顯微鏡上的照相系統以及計算機Image-pro plus 5.1圖像分析軟件對bFGF免疫組織化學顯色結果進行拍照和分析。拍照時每劑量組顯色組織切片20倍物鏡下隨機選取18處視野進行拍照存檔，測量時用Image-pro plus 5.1圖像分析軟件以統一的光密度（Density，簡稱為 D）閾值作為測量指標，以光密度值平均值的高低作為衡量各組皮膚bFGF蛋白表達的尺度。

1.8 數據統計

數據資料均采用均數 ±標準差（珋x±s）表示，數據進行方差齊性檢驗后用t檢驗進行多組均數的兩兩比較。

2 結果

2.1 bFGF蛋白的表達部位

正常小鼠皮膚表達bFGF的陽性細胞主要為表皮細胞、真皮成纖維細胞、毛囊和汗腺上皮細胞、皮脂腺細胞和血管內皮細胞。在表皮細胞、毛囊和汗腺上皮細胞胞漿、皮脂腺細胞胞核強表達；成纖維細胞表達較弱，表現為棕黃色顆粒（見圖1A）。造模后，bFGF在上述部位表達均減弱，表現為淡黃色顯色（見圖1B）。給與維生素 E及補益營衛處理后，上述部位bFGF表達明顯增強，表現為棕褐色顯色顆粒（見圖1C、D、E、F）。陰性對照所有皮膚結構均未見陽性顯色。

2.2 免疫組織化學方法分析bFGF蛋白在各組小鼠皮膚的表達

表1顯示，造模后bFGF表達水平顯著降低，與正常組相比有統計學意義（P＜0.05）。補益營衛處理后，高劑量組 bFGF水平顯著增加，與正常組，模型組、VE組、低劑量組相比均有顯著性差異，分別為 P＜0.05，P ＜0.001，P ＜0.05和，P ＜0.05。中、低劑量組、VE組均使下降的 bFGF基本恢復至正常水平，高劑量組蛋白含量與陽性相比增加，有統計學差異（P＜0.05）。

表1 補益營衛對小鼠皮膚bFGF蛋白表達的影響

3 討論

《傷寒論·平脈法》58條中說：“寸口脈緩而遲，緩則陽氣長，其色鮮，其顏光，其聲商，毛發長；遲則陰氣盛，骨髓生，血滿，肌肉緊薄鮮硬。陰陽相抱，榮衛俱行，剛柔相得，名曰強也?！痹诘?9條說：“寸口脈微而澀，微者衛氣衰，澀者榮氣不足，衛氣衰，面色黃，榮氣不足，面色青。榮為根，衛為葉，榮衛俱微，則根葉枯槁……”指出營衛充盛，則肌肉健壯，容光煥發，沒有衰老之象；反之，營衛不足，則面色青黃，衰象顯露。堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factors，bFGF）是一種多功能的細胞因子，具有多種生物活性，可誘導大多數來自中胚層和神經外胚層細胞的有絲分裂，在胚胎形成、血管新生、神經營養和創傷愈合中起重要作用［2］，也與創面愈合和組織修復密切相關［3、4］。bFGF常通過旁分泌或自分泌機制在皮膚組織中發揮重要生理功能。研究結果表明，bFGF及其受體在胎兒和成人皮膚組織中都有陽性表達，且它們的表達量隨著皮膚組織的不斷成熟而逐漸增大，表明皮膚的生長發育、表型和功能的維持以及損傷后的修復可能都需要bFGF參與，并且內源性 bFGF可能是皮膚修復與再生的重要內源性調控因子［5］。bFGF的這些功能與營衛“充皮膚，肥腠理”的功能之間存在共性。衰老時皮膚膠原合成減少，彈性降低，血管生成減少，密度降低，可能與bFGF之間存在內在聯系，也與營衛之間存在內在關聯。

圖1 小鼠皮膚組織bFGF免疫組化顯色（DAB 10×20）

我們在先前的研究中發現，補益營衛能夠增加衰老皮膚中減少的膠原水平。本試驗進一步的機制研究中發現，在小鼠皮膚衰老模型中 bFGF表達減少，與正常小鼠皮膚相比有顯著差異，提示 bFGF表達減少與衰老皮膚膠原減少有內在聯系。補益營衛處理后，bFGF的表達增加，尤其是高劑量組，與其他組包括陽性對照組維生素E組相比都有顯著差異，說明補益營衛處理增加膠原合成的一個重要途徑是通過bFGF實現的，也是補益營衛延緩皮膚衰老的重要原因之一。

［1］HalliwellB，Gutteridge JMC.Free radieals in biology and medicine［M］.3rded，Newyork：Oxford University Press，1999.617.

［2］Aigner A，Ray PE，Czubayko F，etal.Immunolocalization of an FGF-binding protein rev-eals a widespread expression pattern during different stages of mouse embryo devel-opment［J］.Histochem Cell Biol，2002，117（1）：1-11.

［3］Nakada T，Saito Y，Chikenji M，etal.Therapeutic outcome of hyperbaric oxygen and basic fibroblast growth factor on intractable skin ulcer in legs：preliminary report［J］. Plast Rec-onstr Surg，2006，117（2）：646-651.

［4］Akita S，Akino K，Imaizumi T，Hirano A.A basic fibroblast growth factor improved the quality of skin grafting in burn patients［J］.Burns，2005，31（7）：855-858.

［5］陳 偉，付小兵，孫同柱，等.堿性成纖維生長因子及其受體在胎兒和成人皮膚內的表達特征及其意義［J］.中國危重病急救醫學，2002，14（7）：400-403.