5味收澀藥對奶牛乳腺炎病原菌體外抗菌活性的比較

代敏，彭成，萬峰，陳丹丹

（1.成都中醫藥大學中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室，成都610075；2.成都醫學院，成都610083）

5味收澀藥對奶牛乳腺炎病原菌體外抗菌活性的比較

代敏1,2，彭成1，萬峰1，陳丹丹1

（1.成都中醫藥大學中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室，成都610075；2.成都醫學院，成都610083）

采用瓊脂平板二倍稀釋法測定了訶子等5味收澀藥對15個種屬33種120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌濃度，統計分析了它們對葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和單胞菌等共11個種屬的MIC50和MIC90，并采用SPSS17.0軟件中單因素方差分析法比較分析了5味收澀藥分別對葡萄球菌、魯氏不動桿菌和芽孢桿菌等11個種屬菌株抑菌活性的強弱。結果表明，5味收澀藥對受試菌均有較強的抗菌活性，總體以訶子的抗菌活性最強，其次為烏梅和石榴皮，再次為五味子，活性最差為山茱萸；且5味收澀藥對革蘭氏陽性菌的抗菌活性較對革蘭氏陰性菌的活性強。

體外抗菌活性；收澀藥；乳腺炎病原菌

0 引言

收澀藥指具有斂肺澀腸、固精縮尿、止血斂瘡等作用的藥物，其中訶子、石榴皮、烏梅、五味子和山茱萸具有澀腸止瀉，斂肺止咳、殺蟲、驅蟲止痢、補益肝腎等功效[1-4]；現代藥理學研究表明，訶子、石榴皮、烏梅、五味子和山茱萸具有抗病原微生物、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節、驅蟲、抗過敏等藥理活性[5-14]。此外，烏梅、五味子和山茱萸又常作為“藥食同源”植物，被用作功能性保健食品[15,16]。鑒于收澀藥的澀腸止瀉之功效及其抗病原微生物等藥理活性，本試驗旨在對訶子、石榴皮、烏梅、五味子和山茱萸的體外抗菌活性進行比較研究，一方面為其在感染性疾病及保健食品的運用提供科學依據，另一方面為防治奶牛乳腺炎抗菌中藥的篩選及運用奠定基礎，以提高乳品安全。

1 實驗材料

1.1 藥物

訶子、五味子、烏梅、石榴皮和山茱萸共5味收澀藥（同仁堂成都分店）。

1.2 菌株

①質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923（成都抗菌工業研究所）；

②受試菌株：分離于四川成都、綿陽、眉山三地不同規?；膛?，并經VITEK 32全自動微生物分析系統和16S rDNA序列分析鑒定的15個種屬33種120株奶牛乳腺炎病原菌（見表1）。

表1 實驗菌株的種類、數量及代號

表1中，凝固酶陰性葡萄球菌包括5株耳葡萄球菌、5株腐生葡萄球菌、4株木糖葡萄球菌、3株葡萄球菌屬、2株人葡萄球菌以及表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、科氏葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、尼泊爾葡萄球菌各1株；4株鏈球菌包括無乳鏈球菌-（B群）、乳房鏈球菌、牛鏈球菌和緩癥鏈球菌各1株；9株芽孢桿菌包括4株蠟樣芽胞桿菌、3株矮小芽孢桿菌和2株彎曲芽孢桿菌；12株單胞菌包括6株銅綠假單胞菌、3株少動鞘氨醇單胞菌、2株熒光假單胞菌、1株豚鼠氣單菌。

1.3 培養基

Mueller-Hintonagar（OXOID，批號729683）。

1.4 主要儀器

多點接種儀（SAKUMA MIT-P型），VITEK DENSICHEK，LABO AUTOCLAV（MLS-3780型），CO2INCUBATOR(MOC-15A)，調溫電熱套（ZDHW 2000L）。

2 實驗方法

2.1 藥物提取

稱取藥物150.0 g，根據藥物質地不同，分別加入10倍75%乙醇回流提取2 h，過濾，收集濾液；再用8倍75%乙醇回流提取1 h，合并兩次醇提物濾液。濾渣加入8倍蒸餾水回流提取1 h，過濾，收集濾液；再次加入6倍蒸餾水回流提取0.5 h，過濾，收集濾液，合并兩次水提濾液。將水提物和醇提物的濃縮液混合，定容至0.75～2.0 g/mL。

2.2 提取物的滅菌和保存

108℃滅菌2 min，-20℃冰箱保存備用。

2.3 體外抑菌活性試驗

采用瓊脂平板二倍稀釋法測定5味收澀藥對15個種屬120株奶牛乳腺炎病原菌和質控菌株的體外抑菌活性。具體方法參考美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）抗微生物藥物敏感性試驗執行標準[17]。

含藥平板制備：用無菌水對受試藥進行倍比稀釋，將各提取物分別稀釋成1︰2，1︰4，1︰8，1︰16，1︰32，1︰64，1︰128，1︰256共8個梯度。在一次性無菌培養皿中分別加入不同濃度梯度的稀釋藥液1 mL和14 mL滅菌的MH培養基，充分混勻，烘干至表面無水蒸氣。以平板內加入1 mL生理鹽水代替藥物制備陽性對照平板。

菌液配置：用麥氏比濁儀將受試菌和質控菌用無菌生理鹽水調至菌液為0.5麥氏濃度。

最低抑菌濃度（MIC）的測定及結果判定：采用多點接種儀將菌液加入不同質量濃度梯度的含藥平板和陽性對照平板，并以無菌生理鹽水代替菌液作陰性對照。37℃恒溫培養18～24 h后觀察各菌株的生長情況。在陰性、陽性對照成立的條件下，以平板內無細菌生長的藥物最小濃度為此藥對該菌株的最低抑菌質量濃度。

2.4 數據統計

對含4株以上的同種屬菌株，分別統計其抑制50%和90%菌株的最低抑菌濃度，即MIC50和MIC90；并用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析法比較分析5味收澀藥對同種屬菌株抑菌活性的強弱。

3 結果與分析

3.1 5味收澀藥的最低抑菌濃度

采用瓊脂平板二倍稀釋法測定了訶子、五味子、烏梅、山茱萸和石榴皮對15個種屬120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌濃度，結果如表2所示。

表2 5味收澀藥對奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌質量濃度g/L

由表2可以看出，訶子、五味子、烏梅、山茱萸和石榴皮5味收澀藥對15個種屬33種120株奶牛乳腺炎病原菌和質控菌均有較強的抗菌活性，其最低抑菌質量濃度因藥物和菌株種屬差異而明顯不同。

3.2 5味收澀藥的MIC50和MIC90

統計分析了訶子等5味收澀藥對金葡菌、凝固酶陰性葡萄球菌、吉氏庫特氏菌、巨型球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、單胞菌屬、魯氏不動桿菌、陰溝腸桿菌、產吲哚金黃桿菌和芽孢桿菌共11個種屬菌株的MIC50和MIC90，結果如表3所示。

比較分析訶子、五味子、烏梅、山茱萸和石榴皮的MIC50和MIC90，發現體外抗菌活性最強的是烏梅和石榴皮，其中烏梅除對陰溝腸桿菌的MIC50為12.50mg/ml，對大腸埃希菌、單胞菌、產吲哚金黃桿菌和芽孢桿菌的MIC50為6.25 mg/mL外，對其余種屬菌株的MIC50均為3.13 mg/mL；而石榴皮除對大腸埃希菌、單胞菌、魯氏不動桿菌和陰溝腸桿菌的MIC50分別為25.00～50.00，6.25～25.00，3.13～6.25 g/L和6.25 g/L外，對其余種屬菌株的MIC50均介于1.56～3.13 g/L。其次為訶子，對革蘭氏陰性菌的MIC50和MIC90分別為5.00～10.00 g/L和2.50～20.00 g/L，而對革蘭氏陽性菌的MIC50和MIC90均介于1.25～5.00 g/L。再次為五味子，除對大腸埃希菌、單胞菌和陰溝腸桿菌的MIC50和MIC90較高外（8.33～33.33 g/L），對其余種屬菌株的MIC50和MIC90均介于4.17～8.33g/L。抑菌活性相對最差的是山茱萸，除對大腸埃希菌和陰溝腸桿菌的MIC50和MIC90為25.00 g/L，對凝固酶陰性葡萄球菌、單胞菌和魯氏不動桿菌的MIC90分別為6.25～12.50，12.50～25.00和6.25～12.50 g/L外，對其余種屬菌株的MIC50和MIC90均為12.50 g/L。

3.3 5味收澀藥體外抗菌活性的比較分析

用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析法比較分析了訶子、五味子、烏梅、山茱萸和石榴皮5種收澀藥對不同種屬菌株體外抑菌活性的強弱，結果如表4所示。

由表4可以看出，菌株種屬不同，5味收澀藥表現出的抑菌活性亦明顯不同。對于金葡菌，以石榴皮（2.46 g/L）的抗菌活性最強，與五味子、烏梅和山茱萸具有統計學差異；其次為訶子（3.75 g/L）和烏梅（4.30 g/L）；再次為五味子（7.74 g/L）；最差為山茱萸（11.72 g/L），其最低抑菌濃度顯著高于石榴皮、訶子和烏梅（P＜0.001）。對于凝固酶陰性葡萄球菌，以烏梅（3.53 g/L）和訶子（3.64 g/L）的體外抑菌活性最強，與五味子和山茱萸有統計學差異（P＜0.001）；其次為五味子（7.46 g/L）和石榴皮（8.56 g/L）；抑菌活性最差為山茱萸。對于吉氏庫特氏菌、巨型球菌、鏈球菌和芽孢桿菌，總體以山茱萸的抑菌活性最差，與訶子、五味子、烏梅和石榴皮有統計學意義；訶子的體外抗菌活性最強，但訶子、五味子、烏梅和石榴皮之間無統計學差異。對于大腸埃希菌，以烏梅（8.46 g/L）和訶子（12.37 g/L）的體外抗菌活性最強；其次為五味子（21.05 g/L）和山茱萸（24.26 g/L），抑菌活性最差的為石榴皮（27.19 g/L）。對于單胞菌、魯氏不動桿菌和陰溝腸桿菌，以訶子和烏梅的抑菌活性最強；其次為石榴皮和烏梅；最差為山茱萸，與訶子、烏梅、五味子和石榴皮比較有統計學差異。對于產吲哚金黃桿菌，以石榴皮（2.82 g/L）的活性最強；其次為訶子（4.38 g/L）和烏梅（5.21 g/L）；再次為五味子（8.33 g/L）；最差為山茱萸（11.46 g/L）。

表3 5味收澀藥對奶牛乳腺炎病原菌的MIC50和MIC90g/L

表4 5味收澀藥對奶牛乳腺炎病原菌體外抑菌活性的比較分析（X±S）g/L

4 討論

本研究通過瓊脂平板二倍稀釋法測定了訶子、烏梅、石榴皮、五味子和山茱萸對15個種屬33種120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌濃度，一方面排除了試管法中藥物顏色對實驗結果判定的影響，避免了菌株種類及數量少等客觀因素對實驗結果的影響，另一方面通過MIC、MIC50和MIC90的定量分析及現代統計學方法的綜合運用，首次評價了5味收澀藥體外抗菌活的性強弱。結果表明，5味收澀藥中總體以訶子的抗菌活性最強，MIC為1.25～20.00 g/L，對大腸埃希菌和陰溝腸桿菌的抑菌活性相對最差，與李仲興等[18]報道一致，其次為烏梅和石榴皮，其中烏梅的MIC為0.78～12.50 g/L，與文獻[19,20]報道略有差異；石榴皮的MIC為1.56～50.00 g/L，與文獻[21]報道出入較大，分析其原因，可能與藥物產地、批次、提取方法及菌株來源等的差異有關，具體原因是否如此，有待進一步分析。再次為五味子，MIC為2.08～33.33 g/L。相對活性最差為山茱萸，MIC為1.56～25.00 g/L，除對大腸埃希菌的活性略強于石榴皮外，對其它種屬受試菌的抑菌活性均弱于訶子、烏梅、石榴皮和五味子。比較分析藥物對不同種屬菌株的抑菌活性差異，發現5味受試藥對革蘭氏陽性菌的抗菌活性較對革蘭氏陰性菌的活性強，且不同藥物對不同種屬的菌株活性差異較大，以石榴皮表現尤為明顯，對金葡菌和產吲哚金黃桿菌在5味收澀藥中活性最強，而對大腸埃希菌的活性又最弱，這也提示我們臨床選用收澀藥防治感染性疾病時，應針對具體病情及其感染病原的種類選用相對較為敏感的抗菌中藥。此外，本研究還對收澀藥五倍子的抗菌活性進行了研究，表明其抗菌活性均強于本文中受試的5味藥；結合對清熱藥、解表藥和化濕藥等中藥體外抗菌活性的系統比較研究，筆者發現以收澀類藥物的體外抗菌活性最強，而關于收澀藥防治奶牛乳腺炎的臨床運用情況又是否如此，卻有待于后續“收澀藥體內抗菌活性及其防治奶牛乳房炎的臨床療效”等研究的深入探討。

[1] 趙國平,戴真,陳仁壽.中藥大辭典[M].2版.上海:上?？茖W技術出版社,2006:858-860.

[2] 楊麗平,楊永紅.石榴皮的研究進展[J].云南中醫中藥雜志,2004,25(3):45-47.

[3] 王貴林,張昊.烏梅不同藥用部位對豚鼠離體膽囊平滑肌的作用[J].長江大學學報：自然科學版,2008(5):6-8.

[4] 邊才苗,楊云斌,費杰.五味子提取物體外抑菌作用初探[J].浙江中醫藥大學學報,2009,33(1):122-123.

[5] AIM M J.KIM C Y,LEE J S,et al.Inhibition of HTV-1 Integrase by Galloyl Glucoses from Terminalia Chebula and Flavonol Glycoside Gallates from Euphorbia Pekinensis[J].Planta Med,2002,68(5):457-459.

[6] PRASAD L,KHAN T H,JAHANGIR T.et al.Chemomodulatory Efects of Terminalia Chebula against Nickel Chloride Induced Oxidafive Stress and Tumor Promotion Response in Male Wistar Rats[J].J Trace Elem Med Biol,2006,20(4):233-239.

[7] 王軍,張秀鳳,宋予震,等.訶子粗提物影響家兔離體小腸運動的試驗[J].中國獸醫雜志,2010,46(1):17-19.

[8] GUO S,DENG Q,XIAO J,et al.Evaluation of Antioxidant Activity and Preventing DNA Damage Effect of Pomegranate Extracts by Chemiluminescence Method[J].J Agric Food Chem,2007,55(8):3 134-3 140.

[9] ZHANG Q,JIA D,YAO K.Antiliperoxidant Activity of Pomegranate Peel Extracts on Lard[J].J Nat Prod Res,2007,21(3):211-216.

[10] 徐真真,馮錦和,陸惠文,等.石榴皮提取物對小鼠氧化應激狀念的改善作用[J].中藥材,2008,31(8):1 193-1 196.

[11] 阮毅銘.烏梅的化學成份及藥理作用概述[J].中國醫藥導刊,2008,10(5):794-795.

[12] 陳榮華,吳向陽,仰榴青,等.五味子醇提殘渣中粗多糖的體外抗氧化活性研究[J].時珍國醫國藥,2009,20(6):1 512-1 513.

[13] WANG Y,LI Z Q,CHEN L R,et al.Antiviral Compounds and One New Iridoid Glycoside from Comus Officinalis[J].Progress in natural science,2006,16(2):142-146,

[14] 姚瑞芹,張麗,張蘭,等.山茱萸環烯醚萜苷對局灶性腦缺血模型大鼠BDNF及其受體TrkB表達的影響[J].中國藥理學通報,2009,25(11):1 535-1 536.

[15] 趙海智,李國玉,白天紅.五味子果漿對乳酸菌生長的影響及五味子酸奶的加工[J].中國乳品工業,2003,31(4):28-30.

[16] 張艷萍,尤玉如,戴志遠.山茱萸多糖體外清除自由基和抗氧化作用研究[J].中國食品學報,2008,8(6):18-22.

[17] 孫長貴譯.抗微生物藥物敏感性試驗執行標準(第十六版信息)[M].2006,M100-S16.

[18] 李仲興,王秀華,岳云升,等.訶子對335株臨床菌株的體外抑菌活性的研究[J].中國中醫藥科技,2000,7(6):393-394.

[19] 劉東梅,畢建成,郄會卿,等.黃芩、黃連、烏梅、金銀花、敗醬草對產AmpC β-內酰胺酶細菌的體外抑菌作用[J].河北中醫,2008,30(6):654-655.

[20] 李仲興,王秀華,趙建宏,等.烏梅對308株臨床菌株的抑菌效果[J].中國中醫藥信息雜志,2007,14(11):41-42.

[21] 陳雪珊,高曉黎.石榴皮提取液、濃縮液、冷干粉末及石榴皮軟膏的體外抑菌試驗[J].新疆醫科大學學報,2009,32(5):565-567.

Comparative study on antibacterial activity in vitro of 5 kinds of astringent therapy herbs against pathogenic bacteria from dairy cow with mastitis

DAI Min1,2，PENG Cheng1，WAN Feng1，CHEN Dan-dan1
（1.State Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of TCM Resources,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China;2.Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China）

The agar dilution assay was used to test the minimal inhibitory concentration for 5 astringent therapy herbs to 120 strains pathogenic bacteria from dairy cow with mastitis.To compare antibacterial activity,one-factor analysis of variance(ANOVA),MIC50and MIC90were used for statistical analysis.The results showed that 5 astringent therapy drugs had strong antimicrobial activity against 120 clinical isolates from cows.And Terminalia chebula Rotz had strongest antibacterial effects;dark plum and pomegranate peel had higher antibacterial effects;Schisandra had high antibacterial effects;cornus officinalis had the lowest antibacterial activity.Furthermore,compared with gram-negitive germs,all drugs showed a strong antibacterial activity to gram-positive germs,and the experimental drug showed different antibacterial activity to different species of experimental bacteria.

in vitro antibacterial activity;astringent therapy herbs;pathogenic bacteria from mastitis

TS252.1

A

1001-2230（2011）02-0041-04

2010-10-12

國家“十一五”支撐重點項目（2009BAI84B04）。

代敏（1974—），女，副教授，主要從事抗菌中藥的藥效和毒理研究。

彭成