一株生防菌LX-07的鑒定及其拮抗物的理化特性

王金愛，許文濤，，梁志宏，張雅楠，羅云波，黃昆侖，，*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，食品安全檢測與風險評估實驗室，北京100083; 2.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心(北京)，北京100083)

一株生防菌LX-07的鑒定及其拮抗物的理化特性

王金愛1，許文濤1，2，梁志宏2，張雅楠1，羅云波1，黃昆侖1，2，*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，食品安全檢測與風險評估實驗室，北京100083; 2.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心(北京)，北京100083)

LX-07菌株是從玉米根系土壤中分離篩選獲得的一株具有抗真菌活性的細菌，通過菌落、菌體形態及16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌。抑菌譜測定結果表明，該菌產生的拮抗物對常見植物病原真菌具有不同程度的拮抗作用，表現廣譜抗真菌活性。以鏈格孢霉作為指示菌，對拮抗物的理化特性進行了研究，結果表明:拮抗物在pH8.0下，在40～100℃范圍內，抑菌活性不發生變化，121℃處理30min后抑菌活性略有下降，但仍為對照的90%以上;在室溫下，pH2.0～12.0范圍內拮抗物保持穩定，抑菌活性不受影響;拮抗物對胰蛋白酶不敏感，對胃蛋白酶、蛋白酶K敏感。

枯草芽孢桿菌，抗真菌，理化特性

1 材料與方法

1.1 實驗材料

LX-07菌株 本實驗室從玉米根系土壤中分離篩選到的拮抗細菌;用于抗真菌活性測定的靶標植物病原菌鏈格孢霉(Alternaria alternate)、疣孢青霉(Penicillum Ver uourlosum Peyrone)、赭 曲 霉(Aspergillus ochraceus)、綠色木霉(Trichoderma viride)由中國農業大學食品科學與營養工程學院微生物實驗室分離鑒定和保存;油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、 小 麥 赤 霉 病 菌 (Fusarium graminearum)、棉花枯萎病菌(Cotton-wilt Fusarium)購自中國農業微生物菌種保藏管理中心，保存編號分別為36169、30941、36173;PDA、NA、NB培養基的配制 參照文獻［6］，其中PDA培養基用于供試病原真菌的培養，NA、NB用于培養LX-07菌株。

1.2 菌種的鑒定

1.2.1 形態特征觀察 菌株LX-07的形態特征分析參照《常見細菌系統鑒定手冊》［7］和《伯杰細菌鑒定手冊》［8］。

1.2.2 16S rDNA序列分析 提取菌株LX-07基因組總DNA［9］。16S rDNA的克隆采用細菌的通用引物27F(AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)和1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)進行PCR擴增［10］。PCR反應體系(30μL)為:DNA(約25ng/μL)2μL，10×PCR Buffer 3μL，dNTPs(各2.5mmol/L)1.5μL，引物27F和引物1492R(各10μmol/L)各1.5μL，Taq酶(5U/μL)0.4μL，補水至30μL。PCR擴增程序為: 95℃變性5min;進行35次循環擴增反應(95℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸90s);72℃延伸7min。擴增產物送至北京華大基因研究中心測序，測序后獲得的16S rDNA序列在NCBI網站用Blast進行序列比對分析。

1.3 LX-07菌株拮抗物的分離

挑取固體平板上的LX-07單菌落接入NB培養基(50mL搖瓶裝液量為10mL)，37℃，200r/min條件下振蕩培養10～12h，得到種子液，將種子液以2%的接菌量轉接于NB培養基，37℃，200r/min條件下振蕩培養72h。發酵液4℃，11000r/min離心10min，棄菌體收集上清液備用，此上清液即為LX-07菌株分泌的拮抗物。

1.4 拮抗物的抑菌實驗

將1.1中的7種病原真菌接種于PDA平板上，于28℃恒溫培養箱培養3d，在菌落周圍8mm處放上直徑為6mm的無菌濾紙片，濾紙片上滴加10μL拮抗物，對照以等量的無菌水代替，繼續培養14～18h，觀察抑菌情況。

1.5 拮抗物穩定性研究

1.5.1 熱處理 取8只離心管，每只離心管中添加1mL拮抗物(pH8.0)，分別于40、50、60、70、80、90、100、121℃條件下靜置處理30min，室溫(25℃)作為對照。以鏈格孢霉作為指示菌，按1.4的方法做抑菌實驗，實驗重復三次。

1.5.2 pH處理 取10只離心管，每只離心管中添加1mL拮抗物，用6mol/L的鹽酸和10mol/L的NaOH于室溫下分別調pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、 10.0、11.0、12.0，靜置處理12h，再依次調pH至8.0，用無菌水定容至2mL，對照為原拮抗物，pH為8.0。抑菌實驗同上，實驗重復三次。

1.5.3 蛋白酶處理 取LX-07菌株拮抗物分別與豬胰腺胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K混合，并使酶的終濃度為0.5mg/mL，37℃酶作用2h后，100℃滅酶處理5min。其中胃蛋白酶處理時pH為2.0，豬胰腺胰蛋白酶處理時pH為8.0，蛋白酶K處理時pH為7.5，且含有10mmol/L的CaCl2。處理后調pH至8.0，以未處理的拮抗物作為對照，pH為8.0。抑菌實驗同上，實驗重復三次。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

2.1.1 LX-07的形態和培養特征 油鏡下觀察，LX-07菌體呈桿狀，革蘭氏染色結果為陽性，有芽孢。LX-07菌株在平板上37℃培養12h后，單個菌落呈圓形，乳白色，不透明，邊緣整齊。

2.1.2 LX-07的16S rDNA序列及同源性分析LX-07的16S rDNA的序列長度為1545bp(圖1)，BLAST程序比較分析發現它與枯草芽孢桿菌的56個菌株的序列同源性均達到99%，其中登錄號為AB110598的枯草芽孢桿菌菌株的16S rDNA序列大小為1545bp，與LX-07的16S rDNA大小相同，它們序列同源性也達到了99%，證明LX-07為枯草芽孢桿菌。

圖1 菌株LX-07的16S rDNA序列

2.2 拮抗物的抑菌實驗

濾紙片法抑菌實驗結果見圖2，圖中1、2分別為拮抗物和無菌水。結果表明，LX-07菌株的拮抗物對綠色木霉沒有抑菌活性，對供試的其它6種病原菌具有不同程度的抑菌活性。其中對鏈格孢霉拮抗能力最強，對疣孢青霉的拮抗能力最弱。形成的抑菌圈在28℃放置4d后仍然存在。表明LX-07菌株具有抑菌譜廣、拮抗活性穩定的特性。

2.3 拮抗物穩定性研究

2.3.1 熱穩定性 圖3表明:LX-07的拮抗物經40～100℃不同溫度處理30min后，抑菌活性與室溫對照相比沒有變化。121℃處理30min后抑菌圈大小略有下降，但仍然保持對照的90%以上。

別小妹等［11］報道的枯草芽孢桿菌fmbR抗菌物質有極高的熱穩定性，pH7.0，120℃處理3h仍然保持原來活性不變;Glulino Bernal［12］等的研究結果表明Bacillus subtilis產生的抗菌活性物質在100、120℃分別處理 20min后抑菌圈大小不變;Saravanakumar Kavitha等［13］報道的一種來源于 Bacillus polymyxa VLB16菌株的抗真菌蛋白在120℃處理15min后抑菌活性不受影響。

圖2 LX-07拮抗物的抑菌圖

圖3 熱處理對LX-07拮抗物穩定性的影響

可見，LX-07菌株拮抗物與報道的研究結果有相似性，都表現出很高的熱穩定性。但由于處理的時間不同，因此結果并不完全一致。

2.3.2 pH穩定性 圖4表明:LX-07的拮抗物在室溫下經不同pH處理12h后，抑菌圈大小與對照相比不變，表明室溫下，抗菌物質對pH的穩定性很好，在pH2.0～12.0的范圍內，表現出很高的穩定性。

圖4 pH處理對LX-07拮抗物穩定性的影響

別小妹等［11］報道的研究結果與本實驗類似，不同之處是處理的時間不同。別小妹等的研究結果表明枯草芽孢桿菌fmbR抗菌物質在pH2.0～12.0范圍內處理5h活性下降，而本實驗處理的時間更長且活性不變，因此LX-07的拮抗物有更好的pH穩定性; San-Lang Wang等［14］的研究結果顯示，Pseudomonas aeruginosa K-187分泌的一種抗真菌蛋白具有良好的熱穩定性，100℃處理50min活性不變，但是對pH處理敏感，在pH5～7時最穩定，pH低于3.0時活性僅為原來的66%，高于11.0時抑菌活性完全喪失; G.Y.YU等［15］報道的 Bacillus subtilis的抗真菌物質iturin在pH3～11條件下，20℃處理24h，抗菌效果不受影響，而本實驗的pH范圍更寬。

2.3.3 蛋白酶穩定性 LX-07的拮抗物經0.5mg/mL的不同蛋白酶處理后的抑菌活性結果見圖5。從圖中可以看出，豬胰腺胰蛋白酶處理過的拮抗物活性不變，而胃蛋白酶和蛋白酶K處理過的活性分別為對照的60%和80%。結果表明，在酶的終濃度為0.5mg/mL的條件下，拮抗物對豬胰腺胰蛋白酶不敏感，對胃蛋白酶最敏感，對蛋白酶K也有較高的敏感性。

圖5 拮抗物經不同蛋白酶處理后的抑菌活性

3 討論

枯草芽孢桿菌應用于植物病害生物防治的研究已經有很多年的歷史。尹志剛等［16］從樟樹組織表皮內分離出一株枯草芽孢桿菌，在小麥的盆栽和大田實驗中均對小麥紋枯病菌表現出良好的抑菌活性;邢介帥等［17］從枯草芽孢桿菌T2中純化出一種高產蛋白酶，該酶對棉花枯萎病菌的孢子萌發、菌絲生長有明顯的抑制作用。本實驗研究的枯草芽孢桿菌LX-07產的抗真菌物質，能抑制多種植物病原真菌，顯示了其在農業上的潛在應用價值。

國內外對于枯草芽孢桿菌抗菌物質穩定性研究有很多報道，本研究結果與以往的研究結論有相似之處，例如LX-07的拮抗物與別小妹等［11］報道的fmbR抗菌物質均有很高的熱穩定性和pH穩定性，但是兩者對蛋白酶處理的敏感度不同，而且后者只對細菌有抑菌活性，對真菌沒有明顯的抑制效果，LX-07的拮抗物則對植物病原真菌有廣譜抑菌性?？梢姳狙芯颗c以往報道并不相同，因而該拮抗物有可能包含新的抗菌物質。

本研究下一步將對此拮抗物進行分離純化，以得到純的抗真菌物質，并對純化后的抗真菌物質的理化特性做詳細研究，以期為該抗真菌物質在農作物真菌病害防治上的應用提供依據。

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Identification of a bio-control bacteria LX-07 and characterizations of its antifungal substance

WANG Jin-ai1，XU Wen-tao1，2，LIANG Zhi-hong2，ZHANG Ya-nan1，LUO Yun-bo1，HUANG Kun-lun1，2，*
(1.Laboratory of Safety Detecting and Risk Assessment，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.Supervision，Inspection and Testing Center of Genetically Modified Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

A bio-control bacteria LX-07 producing antifungal substance was isolated from the soil of maize roots.It was identified as Bacillus subtilis on the basis of morphological characters as well as the sequence analysis of 16S rDNA.The inhibitory test showed that the antifungal substance produced by LX-07 exhibited extensive antagonistic effect on quite a number of plant pathogenic fungi.Characterizations of the antifungal substance were assayed with Alternaria alternate as indicative bacteria.The results suggested that the antagonists were very stable within the tested range from 40℃ to 100℃ under pH8.0，but with 90%original activity after treated at 121℃ for 30min.In addition，the antifungal substance showed no change from pH2.0～12.0 under room temperature.With regard to the three proteinases，the results indicated that the antifungal substance was sensitive to pepsin and proteinase K，but it was very stable to trypsin.

Bacillus subtilis;antifungal;characterization

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0088-04

隨著人民生活水平的提高，對食品安全性的要求也越來越高。為了解決農副產品產量和質量之間的矛盾，達到防治植物病蟲害、減少化學農藥使用量的目的，各國政府和人民越來越關注使用生物防治控制植物病蟲害［1-2］。生物農藥在保護環境、保證人類健康和農業可持續發展進程中，將發揮愈來愈重要的作用?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)廣泛存在于自然界中，是植物體內常見的內生細菌，對人體無毒無害，不污染環境，能產生多種抗菌素和酶［3-5］，具有廣譜抗菌活性和較強的抗逆能力，因此成為近年來植物病害防治研究的熱點。本實驗室從玉米根系土壤中分離純化得到一株拮抗菌株，通過濾紙片法證實該菌產生的拮抗物對常見的植物病原真菌有不同程度的抑菌活性。本文根據該菌株的形態特征及16S rDNA序列分析對其進行了分類鑒定，并對其產生的拮抗物的理化性質進行了研究，為正確選擇抗菌活性物質的分離純化工藝和該內生細菌的進一步研發提供理論依據。

2009-12-22 *通訊聯系人

王金愛(1984-)，女，碩士，主要從事抗菌蛋白的提取、分離和純化研究。

國家高技術研究與發展計劃(863)項目(2006AA10Z440);國家自然基金項目(308007708)資助。