產堿性脂肪酶熱帶假絲酵母LYSC-3的篩選、鑒定及發酵條件的優化

肖凱夫，郭 晟，龐一林，林元山，*，鄒冬生，*

(1.湖南農業大學東方科技學院，湖南長沙410128; 2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128)

產堿性脂肪酶熱帶假絲酵母LYSC-3的篩選、鑒定及發酵條件的優化

肖凱夫1，2，郭 晟1，2，龐一林1，林元山1，2，*，鄒冬生1，2，*

(1.湖南農業大學東方科技學院，湖南長沙410128; 2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128)

以橄欖油為唯一碳源，以溴鉀酚紫為顯色劑，采用瓊脂平板法從富含油脂的土壤中篩選到一株產堿性脂肪酶野生型菌株LYSC-3。經形態學、生理生化和分子生物學的鑒定，確定菌株LYSC-3為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)。經發酵條件優化，菌株LYSC-3的最佳產堿性脂肪酶的發酵條件為:橄欖油10g·L-1、蛋白胨5g·L-1、蔗糖20g·L-1、(NH4)2SO40.5g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2g·L-1，K2HPO40.2g·L-1，pH8.0，35℃，150r·min-1搖床振蕩培養3d，獲得堿性脂肪酶最高酶活力達38.6U·mL-1。

堿性脂肪酶，發酵條件，假絲酵母，菌株篩選

1 材料與方法

1.1 實驗材料

篩選土樣 采自瀏陽河地區富含油脂的土壤;橄欖油 希臘原產;溴鉀酚紫 購于天津市博迪化工有限公司;油脂同化平板培養基、發酵培養基、保藏培養基 均參考文獻［4］;其它試劑 均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 產堿性脂肪酶菌株的篩選、發酵條件優化

1.2.1.1 初篩 在配制好的油脂同化平板培養基中加入0.01%溴甲酚紫，溴甲酚紫為指示劑，溴甲酚紫在pH5.2～6.8，顏色由紫變黃［5］。采用十倍稀釋涂布接種法，35℃培養2～4d，根據平板上黃色變色圈直徑與產脂肪酶菌株菌落直徑的比值，進行菌株活力初篩，按水解圈直徑與菌落直徑之比挑取菌株，接種斜面;選擇比值大的菌株進一步進行搖瓶發酵并測定脂肪酶活力。

1.2.1.2 復篩 將初篩產堿性脂肪酶活力相對較高的菌種接種于100mL/250mL搖瓶發酵培養基中，35℃，200r·min-1搖床振蕩培養 72h，將發酵液8000r·min-1離心20min，沉淀用于計算生物量，上清液用于測定酶活力，選擇酶活力大的菌株進一步進行發酵條件的優化。

1.2.1.3 發酵條件優化 設計單因素實驗，對菌株LYSC-3的培養基碳源(橄欖油)、培養基初始pH、培養溫度等單因素進行參數優化。

1.2.2 酶活測定方法 堿滴定測酶活［6］，重復3次，取平均值。

1.2.3 分離菌種的鑒定 參照《常見真菌鑒定手冊》［7］進行菌種LYSC-3的生理生化鑒定。

1.2.4 26s RNA的PCR擴增、序列分析和系統發育樹的構建［8］以NL1(5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')和NL4(5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'為引物PCR擴增，經北京諾賽基因組研究中心有限公司測序26s RNA序列，LYSC-3菌株的測序結果在NCBI數據庫中進行Blastn搜索，獲得與其同源性相近的序列，然后用Clustal X1.8軟件進行多序列比對，最后利用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹，采用Kimura雙參數模型計算各序列分化距離，缺少和不確定的位點在計算中被省略，Boot-strap置信值估算次數1000次。

1.2.5 生物量的測定 采用濕重法測定LYSC-3菌株的生物量，將發酵液以8000r·min-1于高速離心機中離心20min，并用濾紙吸取菌體表面水，稱量菌體濕重量，計g·L-1。

2 結果與分析

2.1 產堿性脂肪酶菌株的篩選

從富含油脂的土樣中采集樣品，按水解變色圈直徑與菌落直徑的比值大小挑選菌株，得到比值大于4.0的脂肪酶菌株21株，比值大于6.5的脂肪酶菌株7株，經反復初篩，搖瓶復篩后，獲得1株酶活力相對較高的菌株，標注為LYSC-3菌株，該菌株水解變色圈直徑與菌落直徑的比值為9.6，該菌株的溴鉀酚紫顯色平板見圖1。

由于微生物產脂肪酶可降解培養基中底物橄欖油產生脂肪酸和甘油，脂肪酸使中性的油脂同化平板培養基pH降低，培養基部分局域顏色由紫變黃，因此，平板上黃色變色圈直徑與產脂肪酶菌株菌落直徑的比值初步反映了脂肪酶活力大小。由圖1可以看出，所獲菌株產脂肪酶活力高且酶活穩定。

圖1 菌株Candida tropicalis LYSC-3在篩選培養基上的菌落形態

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的生理生化特性 菌株 LYSC-3在麥芽汁瓊脂上菌落為奶油色，稍有光澤，軟而平滑。培養4d后，可看到假菌絲。在顯微鏡下呈現球狀或卵狀形，見圖2。菌株LYSC-3兼性厭氧發酵葡糖;接觸酶實驗為陽性;葡萄糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、木糖和阿拉伯糖為陽性，鼠李糖為陰性，從形態學初步確定為酵母屬。

圖2 Candida tropicalis LYSC-3光學顯微照片(放大1000倍)注:A-未染色;B-結晶紫染色。

2.2.2 遺傳學特征 為了進一步確定菌株 LYSC-3的分類學地位，通過PCR擴增26s RNA得到603bp的DNA片段，將片段回收純化后測序，測序結果提交GenBank，獲得登錄號GU388393，使用生物軟件構建進化樹，見圖3。LYSC-3菌株與Candida屬內各菌株的同源性在95.90%～99.90%之間，系統發育分析歸于同一分枝，結合形態學和生理生化特征，確定其為Candida tropicalis屬，命名為 Candida tropicalis LYSC-3菌株。

圖3 Candida tropicalis LYS-3菌株及相關菌株的系統發育樹

2.3 LYSC-3菌株的產酶條件的優化

為確定LYSC-3菌株的產酶條件，設計單因素實驗梯度，對發酵溫度、培養基起始pH、橄欖油含量進行發酵條件初步優化，將測定的酶活力用excel作圖，結果見圖4～圖6。

圖4 發酵溫度對菌株Candida tropicalis LYSC-3產脂肪酶的影響

發酵溫度對菌株Candida tropicalis LYSC-3產脂肪酶的影響見圖4，從圖4可知，Candida tropicalis LYSC-3在30～37℃之間生長良好，菌體濕重在16～17g·L-1之間。35℃時，該菌的脂肪酶活力達最大，達35.2U·mL-1，其次為37℃和32℃，分別為33.7U·mL-1和30.8U·mL-1，經t檢驗，這三個溫度的脂肪酶活力與低溫區和高溫區比較，均具顯著性差異(p＜0.05)。

從圖5可知，在35℃條件下，Candida tropicalis LYSC-3在發酵培養基的起始pH5～7之間生長良好，菌體濕重在15～16g·L-1之間。發酵培養基起始pH為8時，該菌的脂肪酶活力達最大，達36.4U·mL-1;然后隨著pH的增加，該菌的脂肪酶酶活力和生物量均顯著降低，經t檢驗，該菌株的脂肪酶活力與其低pH區和高pH區比較，均具顯著性差異(p＜0.05)，可見，培養基起始pH影響脂肪酶活力和生物量的大小。

圖5 培養基起始pH對菌株Candida tropicalis LYSC-3產脂肪酶的影響

在35℃，pH8的條件下，在發酵培養基(每1000mL)中橄欖油含量對Candida tropicalis LYSC-3產脂肪酶活力影響見圖6，從圖6可知，欖油含量從0增加至10mL，脂肪酶活力增加較快。橄欖油含量為10mL時，接近最大，達38.6U·mL-1，與橄欖油含量3～6mL比較，具顯著性差異(p＜0.05)，然后隨著橄欖油含量的增加，脂肪酶活力基本趨于穩定。但橄欖油含量對Candida tropicalis LYSC-3生物量的貢獻不明顯，而對脂肪酶產率影響很大，說明橄欖油含量對Candida tropicalis LYSC-3產脂肪酶具有明顯的誘導作用，也是影響脂肪酶分泌的關鍵因素之一。

3 討論

圖6 橄欖油對菌株Candida tropicalis LYSC-3產脂肪酶的影響

目前，通過誘變等手段，獲得脂肪酶產生菌的報道甚多，但酶活力大多在70U·mL-1以下，如曾璐等［9］以三羧酸甘油脂為底物，篩選一株產脂肪酶桿菌，酶活力為68.58U·mL-1;張振乾等［10］從含油土樣中篩選到一株產堿性脂肪酶的產氣腸桿菌，酶活力為66.31U·mL-1;周軍［11］以橄欖油為底物，從富含油脂的土壤中分離篩選到產脂肪酶R-1野生型菌株，酶活力為27.70U·mL-1。本實驗從富含油脂的土壤中篩選到一株產堿性脂肪酶菌株Candida tropicalis LYSC-3，未經任何誘變，在初步優化的發酵條件下，堿性脂肪酶活力就達38.6U·mL-1，可見該菌株具有較大的開發潛力。經形態學和分子生物學鑒定為熱帶假絲酵母Candida tropicalis LYSC-3，關于熱帶假絲酵母產堿性脂肪酶的報道甚少。該菌株可以進一步通過誘變篩選提高酶活，甚至采用基因工程技術對該酶基因進行克隆，有望進一步發掘其潛能。

總之，野生型Candida tropicalis LYSC-3的最佳產堿性脂肪酶發酵條件為:橄欖油10g·L-1、蛋白胨5g·L-1、蔗糖 20g·L-1、(NH4)2SO40.5g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2g·L-1、K2HPO40.2g·L-1，pH8.0，35℃，150r·min-1搖床振蕩培養3d，獲得堿性脂肪酶最高酶活力達38.6U·mL-1。

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Screening，identification of Candida tropicalis LYSC-3 excreting lipase and optimization of fermenting conditions

XIAO Kai-fu1，2，GUO Sheng1，2，PANG Yi-lin1，LIN Yuan-shan1，2，*，ZOU Dong-sheng1，2，*
(1.Orient Science＆Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China; 2.College of Bioscience＆Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

A strain of LYSC-3 was screened by bromocresol purple media agar plate from oil rich soil.LYSC-3 was identified as Candida tropicalis by methods of morphology，physiology and molecular biology.Fermentation conditions were also optimized through single factor.Results indicated that lipase activity reached 38.6U·mL-1when Candida tropicalis LYSC-3 was cultured on the media of olive oil 10g·L-1，peptone 5g·L-1，sugar 20g·L-1，(NH4)2SO40.5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2g·L-1，K2HPO40.2g·L-1，pH8.0，rotated at 150r·min-1at 35℃for 3d.

alkaline lipase;fermentation condition;Candida tropicalis;screening

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0218-03

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一種重要工業酶類，能催化天然底物油脂生成甘油和游離脂肪酸，廣泛應用于食品、制革、飼料、洗滌、油酯化工等傳統工業領域［1］。脂肪酶的來源主要有:植物種子、微生物和動物組織［2］。微生物脂肪酶種類最多，廣泛存在于細菌、酵母和霉菌中，最易獲得并用于大規模生產，且具有比動植物脂肪酶更廣的pH、溫度適應性，因此是工業用脂肪酶的重要來源［3］。近20年來，微生物脂肪酶發酵研究主要集中在高產菌株的篩選。本實驗旨在通過溴鉀酚紫平板顯色法和堿滴定測脂肪酶活法相組合的篩選方案，獲得脂肪酶高產野生菌株，并對其發酵條件進行了優化。

2010-03-17 *通訊聯系人

肖凱夫(1986-)，男，碩士研究生，研究方向:生物化學與分子生物學。

湖南省大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目(DFXYKCSJ003)。