食品中單核細胞增生性李斯特菌的快速分離鑒定

何勇琴，潘迎捷，盧 瑛

(上海海洋大學食品學院，上海201306)

食品中單核細胞增生性李斯特菌的快速分離鑒定

何勇琴，潘迎捷，盧 瑛*

(上海海洋大學食品學院，上海201306)

單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特菌)是一種重要的食源性致病菌，能引起人畜共患李斯桿菌病。本文采用兩種不同的增菌分離方法從散裝牛奶和豬肉中共分離得到8株單增李斯特菌。通過革蘭氏染色、生化鑒定、PCR擴增hlyA基因、16S rDNA測序、血清分型等一系列實驗對可疑菌株進行分析鑒定。綜合實驗結果和其他單增李斯特菌分離標準，探討開發了一種快速分離鑒定單增李斯特菌的方法，該方法可在4～5d內完成單增李斯特菌的分離檢測過程。

單增李斯特菌，快速，分離，鑒定，hlyA基因，血清分型

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品1 豬肉，購于上海黃浦區徽寧路菜市場菜市場;樣品2 散裝牛奶，購于上海郊區;胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB-YE)、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)、BLEB基礎及相應添加劑、Fraser肉湯基礎及添加劑、牛津瓊脂(OXA)基礎(Oxford Agar Base)及相應添加劑、PALCAM培養基基礎及相應添加劑 根據產品說明進行配制;單增李斯特菌生化鑒定套裝 以上產品均購自北京陸橋技術有限責任有限公司;BioFlux DNA提取試劑盒 購自杭州博日科技有限公司;李斯特菌抗血清試劑 購自日本Denka Seiken公司。

1.2 實驗方法

實驗采用了2種方法從樣品中分離單增李斯特菌。其中樣品1參照FDA的分離方法，采用了BLEB增菌液和OXA選擇性培養基，樣品2參照ISO的分離方法，采用了Fraser肉湯增菌液和PALCAM選擇性培養基，此兩種方法的區別在于前增菌和分離方法的不同，鑒定方法完全一致。

1.2.1 預增菌處理 稱取25g樣品1，放入均質袋，加入225mL無菌生理鹽水，均質拍打2min。取25mL樣品2加入225mL無菌生理鹽水，混勻。取樣品1的均質液25mL，無菌條件下加入到225mL的BLEB增菌液中，30℃搖床培養4h，加入選擇性試劑吖啶黃、萘啶酮酸和放線菌酮，30℃搖床培養48h。

取樣品2的均質液25mL，無菌條件下加入到225mL的Half Fraser肉湯中，30℃搖床培養24h，取1mL培養液，加入到10mL Fraser肉湯中，繼續培養至48h。

1.2.2 分離純化 取樣品1的48h增菌液劃線接種于OXA瓊脂平板，36±1℃培養48h。

樣品2的二次增菌液若變黑，梯度稀釋增菌液，選取合適的梯度稀釋液0.1mL涂布于PALCAM瓊脂平板，36±1℃培養48h。

挑取上述兩種平板的可疑菌落劃線接種于TSA-YE瓊脂平板。

1.2.3 革蘭氏染色和生化鑒定 挑取TSA-YE瓊脂平板上已純化單菌落進行革蘭氏染色和生化鑒定，生化鑒定包括TSI三糖鐵實驗、硝酸鹽肉湯、MRVP、尿素酶、糖發酵實驗(七葉苷、木糖、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露醇)。

1.2.4 PCR擴增hlyA基因 將TSA-YE瓊脂平板上菌落接種于TSB-YE，30℃搖床培養15h。按照試劑盒提取可疑菌落的DNA。針對單增李斯特菌的溶血毒素基因hlyA，參考文獻［6］合成hlyA基因引物。上游:5'-ACGCAGTAAATACATTAGTG-3'，下游: 5'-AATAAACTTGACGGCCATAC-3'。上、下游引物由上海生物工程有限公司合成，擬擴增片段大小為372bp。PCR反應體系:DNA模板1.0μL、25μmol/L上下游引物各1.0μL、2.5mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)1.0μL、5U/μL Taq酶0.2μL、10倍緩沖液2.0μL(含 Mg2+)、去離子水13.8μL，總體積20μL。PCR反應程序:94℃預變性5min;94℃ 30s，58℃30s，72℃ 1min，30個循環;72℃延伸7min，10℃保存。反應結束后，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳30min，在凝膠成像系統中讀取擴增結果。

1.2.5 16S rDNA測序 以1.2.4中提取的DNA為模板，采用16S rDNA的通用引物進行PCR擴增，產物交由上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.2.6 血清型鑒定 可疑菌落的血清型鑒定參照李斯特菌抗血清試劑說明書。O抗原采用玻片凝集的方法，H抗原采用試管凝集的方法。

2 結果與分析

2.1 增菌結果

樣品1在BLEB增菌液中培養48h后，除明顯渾濁外無其他現象。樣品2在Half Fraser肉湯中增菌24h，增菌液變黑。這主要是因為Half Fraser肉湯中含有七葉苷，所有的李斯特菌都可以水解七葉苷，水解產物和添加劑中的檸檬酸鐵銨產生顏色反應，使菌液變黑，以此可初步判斷李斯特菌的存在，具體結果見表1。若24h菌液未變黑，繼續培養24h，仍未出現黑色現象，可視為無李斯特菌的存在。

2.2 分離純化

樣品1劃線于OXA瓊脂平板培養48h后，平板上出現直徑約1mm的黑色菌落。此時可初步判斷李斯特菌的存在。樣品2經48h增菌后基本可以斷定有李斯特菌的存在，涂布于PALCAM平板上，平板上出現小的灰綠色菌落，外圍有水解環，進一步證明李斯特菌的存在。

2.3 革蘭氏染色和生化鑒定結果

OXA和PALCAM平板上共挑選出8個可疑菌落。TSA-YE平板上可疑菌落鏡檢結果均為革蘭氏陽性。8個可疑菌落生化鑒定結果完全一致，且和標準菌株的生化反應現象也完全一樣(見表1)。TSI三糖鐵斜面和底部均變黃，發酵葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷，不發酵木糖、甘露醇，MR-VP陽性，硝酸鹽肉湯和尿素酶均為陰性。

2.4 PCR擴增結果

8株實驗室分離的單增李斯特菌PCR檢測全部呈陽性，在400bp附近出現目的條帶，和預期片段大小(372bp)相吻合，而其它兩株同屬異種菌未出現目的條帶，其中陰性對照2盡管出現3條非特異性條帶，但和目的條帶相差甚遠，對實驗結果的判斷干擾甚微。電泳結果見圖1。

圖1 單增李斯特分離株PCR結果注:M:DL-100標樣;1:空白;2、3:陰性對照，為英諾克李斯特菌食品分離株; 4:單增李斯特菌標準菌株ATCC7644; 5～12:Listeria monocytogenes分離株。

2.5 DNA測序結果

16S rDNA測序結果顯示，8株可疑菌株均為單增李斯特菌。

表1 革蘭氏染色和生化鑒定結果

表2 不同預增菌和分離純化方法的比較

2.6 血清型鑒定結果

綜合O抗原和H抗原的反應結果，8株可疑菌落的血清型均為1/2a。

3 討論

通過單增李斯特菌兩種不同分離純化方法的比較可知，采用Fraser肉湯增菌液可以在較短的時間(24～48h)內斷定李斯特菌的存在與否，這也是采用Fraser肉湯增菌液的優點所在。在24h和48h的關鍵點處，可以判斷樣品中單增李斯特菌的存在情況并對后續實驗進行相應安排，節約分離時間和成本。推薦采用Fraser肉湯增菌液，盡管可能會出現漏檢的情況，但由于實驗的目的是大量分離單增李斯特菌，所以可以忽略漏檢的因素。OXA或PALCAM平板培養基，在實際的分離工作中，二者的分離效果未見明顯差異，均可準確分離增菌液中的李斯特菌，因此，在實際的工作中，二者任選其一即可。

本研究在單增李斯特菌的鑒定方面采用了傳統和快速鑒定相結合的方法，一方面保證了結果的正確性;另一方面快速鑒定方法的可行性和真實性可以通過傳統方法得到驗證。鑒于經濟節約的大量分菌目的，在實際大量樣本的分菌工作中，革蘭氏染色和生化鑒定可以略去，因為 Fraser肉湯增菌液和PALCAM(或OXA)選擇性培養基的雙重篩選作用，基本上保障了90%以上的準確性。就PCR擴增而言，hlyA基因是單增李斯特菌所特有的毒力標志基因［7-9］，從理論上保證了PCR擴增檢測單增李斯特菌的正確性。實際的擴增過程也充分證實了PCR鑒定的準確性，因此PCR擴增hlyA基因完全可以作為單增李斯特菌的鑒定指標之一。

本實驗的不足之處在于DNA提取方面，采用了試劑盒提取的方式。試劑盒的方法一定程度上保證了DNA的得率，但用時較長需3h，且費用相對較高，因此建議在大規模分菌時采用其他更為快速簡便的DNA提取方法，以進一步節約時間和費用。

綜上所述，采用Fraser肉湯增菌液結合PALCAM (或OXA)選擇性培養基與PCR擴增(或16S rDNA測序)三大步驟就可以從環境或食品樣本中快速分離鑒定出單增李斯特菌。在單增李斯特菌的分離鑒定方面，行標SN/T0184.1-2005需要5～6d，國標GB/T 4789.30-2008則需要11～16d的時間，而采用本文的三大分離步驟，可以在4～5d內完成單增李斯特菌分離鑒定的整個過程，且可在48h內基本確定食品中是否存在李斯特菌，根據該判定結果進行實驗設計和優化，可大大簡化分離鑒定步驟，降低成本。因此，我們認為本文的方法不僅適合于大量樣本中單增李斯特菌的分離鑒定工作，且適用于一般實驗室的單增李斯特菌分離純化工作。

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Rapid isolation and identification of Listeria monocytogenes in foods

HE Yong-qin，PAN Ying-jie，LU Ying*
(College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

Listeria monocytogenes is an important food-borne pathogenic which can cause listeriosis both in human and animals.8 Listeria monocytogenes were isolated from bulk milk and pork using two different enrichmentisolation methods.A series of experiments(Gram stain，biochemical identification，PCR amplification of hlyA gene，16S rDNA sequencing and serotyping)were employed to analyze and identify the suspicious colonies.A rapid method to isolate and identify Listeria monocytogenes was developed on the basic of the experimental results and the other separation standards.The detection process can be completed within 4～5d using the above method.

Listeria monocytogenes;rapid;isolation;identification;hlyA gene;serotyping

TS201.1

A

1002-0306(2011)03-0215-04

單核細胞增生性李斯特菌(簡稱單增李斯特菌)是一種重要的食源性致病菌，能在冷藏溫度下繁殖，因其細胞的苯酚水浸出物可以誘導單核細胞的生成，從而獲得了“單核細胞增生細菌”這個種名［1］。該菌分布廣泛，對不利因素如低溫、高滲、抗菌物質有抵抗作用，還能在物體表面形成生物膜［2-3］。據報道，4%～8%的水產品，5%～10%的奶及其產品，30%以上的肉制品及15%以上的家禽可被該菌污染。美國、加拿大等國曾多次爆發由該菌引起的食物中毒事件，死亡率達30%以上［4］。由于單增李斯特菌引起的感染病死率高，危害大，引起了國際上的高度重視。WHO將其列為20世紀90年代四大食源性致病菌之一［5］，并在2000年建立了全球監測網，在世界范圍內開展與食源性致病菌相關疾病的監測。1994年我國頒布了食品中單增李斯特菌的標準檢驗方法，并于2003年、2008年分別做了進一步的修改，但目前我國對單增李斯特菌的廣泛種群特征及其生態分布方面的調查尚未見到報道。鑒于這種現狀，廣泛采集各種環境和食品樣品，分離鑒定其中的單增李斯特菌，并探討該菌在環境以及食品中的分布狀況，研究該菌的污染狀況以及分布特征可以為預防李斯特菌病的爆發、流行及追蹤污染源提供理論依據。本文在2008年最新修改單增李斯特菌國標的基礎上，結合FDA(Food and Drug Administration)和ISO (International Organization for Standardization)的檢測方法，比較研究了兩種預增菌和分離純化的方法，采用傳統和快速鑒定相結合的方式驗證可疑菌株，旨在探討開發一種更為經濟效率高的適于大量樣本的單增李斯特菌分離鑒定方法。

2010-03-10 *通訊聯系人

何勇琴(1985-)，女，碩士研究生，研究方向:食品科學與工程。

上海海洋大學博士啟動基金(B-8203-08-0220);上海市教委創新項目(09YZ274);國家科技支撐計劃項目(2008BAD94B09)。