副干酪乳桿菌副干酪亞種L1的培養條件及絮凝活性研究

張莉力，許云賀，李新華

(1.遼寧醫學院，遼寧錦州121001; 2.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110161)

副干酪乳桿菌副干酪亞種L1的培養條件及絮凝活性研究

張莉力1，2，許云賀1，2，李新華2，*

(1.遼寧醫學院，遼寧錦州121001; 2.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110161)

酸漿是我國傳統的鮮薯(或綠豆)淀粉生產工藝中用于淀粉分離凈化的生物絮凝劑。本實驗對從自然發酵的甘薯酸漿中分離的、對甘薯淀粉具有高絮凝活性的副干酪乳桿菌副干酪亞種L1的培養條件和絮凝活性進行了研究。結果表明，副干酪乳桿菌副干酪亞種L1為兼性厭氧菌，在改良TJA培養基初始pH為7.0，在25℃培養48～60h時，菌體的生長狀況和絮凝活性最好;Na+、K+對L1的絮凝活性有顯著的增強作用，但對高溫和胰蛋白酶敏感。

副干酪乳桿菌副干酪亞種，甘薯淀粉，微生物絮凝劑

1 材料與方法

1.1 材料與設備

副干酪乳桿菌副干酪亞種 L1(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei L1) 由本實驗室從自然發酵甘薯酸漿中分離獲得;改良TJA培養基 番茄汁50mL、酵母粉5g、牛肉膏10g、乳糖20g、葡萄糖2g、磷酸氫二鉀2g、吐溫80 1g、醋酸鈉5g，pH6.8±0.2，蒸餾水1000mL，121℃滅菌30min。

高壓滅菌鍋 BKF1-HJK型，北京中西遠大科技有限公司;厭氧培養箱 YOX-I型，上海躍進醫療器械廠;電子分析天平 M4-AL204，蘭州中西儀器;恒溫培養箱 DHP-9082型，金壇市鑫鑫實驗儀器廠;水浴鍋 DK-98-1型，天津泰斯特儀器公司;超凈工作臺 JB-VS-1300型，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司;pH測定計 DHP-9052型，上海一恒科技有限公司;數碼生物顯微鏡 ME21，OLYMPUS。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線的測定 將 L.paracasei subsp. paracasei L1接種至改良TJA培養基中活化48h，再以5%的接種量接種于裝有400mL改良TJA液體培養基的三角瓶中，混合均勻后分別取10mL混合液放入40支無菌試管中，30℃培養，分別培養0、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、38、40、42、44、48、60、72h，測定550nm處的吸光度。以培養時間為橫坐標，相應吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.2 絮凝活性的測定 實驗用絮凝率來定量表示乳酸菌對甘薯淀粉乳的絮凝性［3］。具體方法如下:在100mL量杯中加入5g甘薯淀粉，加水至100mL，搖勻，靜置2min。加入5mL混勻的乳酸菌培養液，混合、攪拌，靜置沉降3min，在上清液面下10mL處取樣。用紫外可見分光光度計測定其上清液吸光度，波長選用550nm，同時，以空白培養基代替上清液作對照實驗，并用以下公式計算其絮凝率:

其中:A-空白上清液的吸光度;B-樣品上清液的吸光度。

1.2.3 溫度對L1生長及絮凝活性的影響 將副干酪乳桿菌副干酪亞種L1接入改良TJA液體培養基中，分別在20、25、30、35、40、45℃下培養2d，測定發酵液的OD值及絮凝活性。

1.2.4 培養基初始pH對L1生長及絮凝活性的影響

用0.1mol/L的HCl和NaOH分別調節改良TJA液體培養基的pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接入菌種，30℃下培養2d，測定發酵液的 OD值及絮凝活性。

1.2.5 通氣量對L1生長的影響 將副干酪乳桿菌副干酪亞種L1接入改良TJA液體培養基中，分別將其放在生化培養箱靜置培養、恒溫振蕩培養箱在90r/min下振蕩培養和厭氧培養箱內厭氧培養，30℃下培養2d，測定發酵液的OD值。

1.2.6 陽離子對L1絮凝活性的影響 配制1%濃度的各鹽溶液:KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2、KAl(SO4)2、Al2(SO4)3、Fe2(SO4)3、FeSO4、ZnSO4，然后分別取各鹽溶液1mL與發酵液一同加入到100mL的甘薯淀粉懸濁液中做絮凝性實驗，計算各菌體濃度下的絮凝率。

1.2.7 加熱溫度對L1絮凝活性的影響 將副干酪乳桿菌 L1的發酵液分別在30、40、50、60、70、80、90℃水浴中加熱30min，然后分別測定加熱后的發酵液對甘薯淀粉懸濁液的絮凝率。

1.2.8 酶處理對L1絮凝活性的影響 用250mmol/L EDTA及蒸餾水各洗兩次菌體，洗過的菌體細胞重新懸于分別加有蛋白酶、糖化酶的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中，30℃保溫，在不同時間取樣，測定絮凝水平。

2 結果與分析

2.1 生長曲線

從圖1菌株L1的生長曲線可以看出，在接種0～4h為延滯期，4～28h為對數生長期，28～60h為穩定期，之后為衰亡期。

圖1 副干酪乳桿菌副干酪亞種L1的生長曲線

2.2 培養溫度對副干酪乳桿菌副干酪亞種L1生長及絮凝活性的影響

分別在20、25、30、35、40、45℃溫度下培養L1 48h，然后測定發酵液的吸光度和絮凝活性，結果見圖2。由圖2可以看出，副干酪乳桿菌副干酪亞種L1在25～35℃范圍內均可正常生長，最適生長溫度為25～30℃，且在此溫度下絮凝活性最高，在45℃下幾乎不生長，也無絮凝活性。

圖2 培養溫度對副干酪乳桿菌L1生長及其絮凝活性的影響

2.3 培養基初始pH對副干酪乳桿菌副干酪亞種L1生長及絮凝活性的影響

培養基初始pH對乳酸菌L1生長及絮凝活性的影響見圖3。從圖3可以看出，副干酪乳桿菌副干酪亞種L1適應較寬的pH范圍，pH6～8條件下生長均較好，絮凝率也較高，pH7.0時菌體生長狀況最好，絮凝活性最高。

圖3 pH對副干酪乳桿菌L1生長及絮凝活性的影響

2.4 通氣量對副干酪乳桿菌副干酪亞種L1生長的影響

分別將三角瓶放置在靜置、恒溫振蕩培養箱和厭氧培養箱中進行培養，觀察通氣情況對菌株絮凝活性的影響。由圖4可以看出，雖然O2通入條件不同，L1菌株均能生長，其中以振蕩方式進行培養的三角瓶中氧氣通入最高，其菌體密度最高、生長狀況最好;厭氧培養的三角瓶中的菌體密度最低。說明L1菌株屬于兼性厭氧菌，有O2或沒O2存在的情況下L1菌株均可生長，有O2時生長狀況更好些。

圖4 不同培養方式對L1生長的影響

2.5 不同陽離子對副干酪乳桿菌副干酪亞種L1絮凝活性的影響

由于微生物菌體表面的結構及電性的不同，不同的離子，或同種離子存在的化合物形式不同，都會不同程度地影響微生物的絮凝活性［4-6］，因為淀粉懸濁液帶負電性，所以選用以下一些陽離子進行絮凝實驗。按照膠體理論，陽離子可以和水中帶負電性膠體微粒的表面電荷結合，使其克服膠體顆粒間的靜電排斥力，從而可以使膠體顆粒脫穩并形成細小的凝聚體。這些凝聚體再與微生物絮凝劑反應形成大絮團，然后快速下沉。

圖5為不同陽離子對L1絮凝活性的影響，Na+、K+等陽離子對L1的絮凝活性均有增強作用，Ca2+、Mg2+、Fe2+對絮凝也有不同程度的促進作用，而Fe3+對絮凝有抑制作用，其余陽離子影響很小，所以，可選Na+作為助凝劑。

圖5 陽離子對L1絮凝活性的影響

2.6 加熱溫度對副干酪乳桿菌副干酪亞種L1絮凝活性的影響

將發酵液在30、40、50和60℃的水浴中加熱30min，然后測定發酵液的絮凝活性，結果見圖6。從圖6中可以看出，溫度對副干酪乳桿菌L1的絮凝活性影響很大，在30℃時，發酵液的絮凝活性還在87.03%，40℃時就降為76.52%，而當溫度在50℃以上時，發酵液就基本不具有絮凝活性。從發酵液對溫度敏感性可以判斷出，菌體上的絮凝因子不具有熱穩定性，絮凝活性受溫度影響較大，所以絮凝因子的化學成分不是多糖類物質，因為多糖類物質的結構不會因高溫而改變，絮凝因子的化學成分有可能是對溫度敏感的蛋白類物質，因為蛋白質在高溫時容易變性，破壞其原有結果，從而使其絮凝活性喪失。這一結果也進一步說明該絮凝因子存在于菌體細胞上。

2.7 酶處理對副干酪乳桿菌L1絮凝活性的影響

圖6 加熱溫度對副干酪乳桿菌L1絮凝活性的影響

不同酶對副干酪乳桿菌L1絮凝活性的影響如圖7。在胰蛋白酶催化水解作用下，絮凝活性物質的絮凝水平迅速下降，在20min時，絮凝活性降低到低于10%。因此，該絮凝活性物質對胰蛋白酶的作用是敏感的，在胰蛋白酶的作用下其絮凝活性顯著下降，這是因為絮凝活性物質在酶的作用下水解，從而引起多聚物分子質量降低所致，證明菌體表面的絮凝因子的化學成分主要是蛋白質。從圖7中也可以看出，α-淀粉酶對副干酪乳桿菌的絮凝活性也有影響，但是影響較小，這也說明菌體表面的絮凝因子的化學成分除了蛋白質之外還含有多糖類物質。

圖7 酶對副干酪乳桿菌L1絮凝活性的影響

3 結論

本研究對從自然發酵的甘薯酸漿中分離到的對甘薯淀粉具有高絮凝活性的副干酪乳桿菌副干酪亞種L1的培養條件及絮凝活性進行了研究，得到以下結論:

L1在30℃改良TJA培養基上，經過4h，L1進入生長的對數期，28h達到穩定期，60h進入衰亡期;在改良TJA培養基初始pH為7.0，振蕩培養條件下，在25℃培養48～60h時，L1菌體的生長狀況和絮凝活性最好;不同的陽離子、溫度及酶對L1的絮凝活性均有影響:Na+、K+對L1的絮凝活性有增強作用，Ca2+、Mg2+、Fe2+對絮凝也有不同程度的促進作用，而Fe3+對絮凝有抑制作用，Al3+、Zn2+影響很小;溫度對副干酪乳桿菌L1的絮凝活性影響很大，當溫度在50℃以上時，發酵液就基本不具有絮凝活性;L1菌株對胰蛋白酶的作用是敏感的，在胰蛋白酶的作用下其絮凝活性顯著下降，α-淀粉酶對副干酪乳桿菌的絮凝活性也有影響，但是影響較小，這說明菌體表面的絮凝因子的化學成分主要為蛋白質，除此之外也含有多糖類物質。

［1］北京粉絲廠，北京大學生物系酸漿研究小組.酸漿為什么能沉淀淀粉［J］.北京大學學報，1974(1):57-63.

［2］張莉力，許云賀，李新華.甘薯酸漿中微生物絮凝性研究［J］.食品工業科技，2010(7).

［3］羅平.RL-2生物絮凝劑的研制及絮凝機理研究［D］.重慶大學，2005.

［4］程金平，張蘭英，張玉玲.微生物絮凝劑的絮凝性能研究［J］.吉林大學學報:地球科學版，2002，32(4):413.

［5］Salehizadeh H，Shojaosadati S A.Extracellular biopolymeric flocculants recent trends and biotechnological importance［J］. Biotechnology Advances，2001，19:371-385.

［6］Jelena Lozo，Branko Jovcic，Milan Kojic.Characterization of a Novel Bacteriocin and an Unusually Large Aggregation Factor of Lactobacillus paracasei subsp.paracasei BGSJ2-8，a Natural Isolate from Homemade Cheese［J］.Curr Microbiol，2007，55: 266-271.

Culture condition and flocculating activity of Lactobacillus paracasei subsp.paracasei L1

ZHANG Li-li1，2，XU Yun-he1，2，LI Xin-hua2，*
(1.Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China; 2.Food Science College of Shenyang Agriculture University，Shenyang 110161，China)

Sweet potato acid steeping liquor was a bioflocculant of separation and purification in sweet potato starch production.It was studied that the culture condition and flocculating activity of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei L1 isolated from natural fermentation of sweet potato acid steeping liquor.Lactobacillus paracasei subsp.paracasei L1 was facultative aerobe.The optimal growth condition was regarded as follows:the optimum temperature and initial pH was 25℃ and 7.0，and cultured for 48～60h.Na+and K+could promote the flocculant formation and the flocculation of L1 was sensitive to high temperature(50℃)and trypsin.

Lactobacillus paracasei subsp.paracasei;sweet potato starch;microbialflocculant

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0139-04

酸漿法生產淀粉是我國勞動人民的一項獨特的創造，一直流傳到今天。把甘薯淀粉乳放置一些時候，經過自然發酵，形成一種具有微酸味的乳白色或黃白色液體，就制成了沉淀淀粉用的“酸漿”?！八釢{”在淀粉生產過程中主要起到促進淀粉與蛋白質等其他雜質的分離，并凈化淀粉的作用［1］。研究表明酸漿中起作用的主要因素不是酸，也不是其它物質，而是酸漿中存在的微生物菌體本身［1-2］。本文對從自然發酵的甘薯酸漿中分離出的對淀粉具有高絮凝活性的副干酪乳桿菌副干酪亞種L1的生長特性及絮凝活性進行了研究，旨在為酸漿發酵劑的制備和生產中絮凝條件的控制提供理論依據。

2010-04-02 *通訊聯系人

張莉力(1977-)，女，博士在讀，講師，主要從事食品微生物方向的研究。

遼寧省教育廳資助項目(2008431)。