用激酶抑制劑法篩選球等鞭金藻抗腫瘤活性物質

郭曉雪，王雪青，王 穎，趙 培

(天津商業大學，天津市食品與生物技術重點實驗室，天津300134)

用激酶抑制劑法篩選球等鞭金藻抗腫瘤活性物質

郭曉雪，王雪青*，王 穎，趙 培

(天津商業大學，天津市食品與生物技術重點實驗室，天津300134)

酪蛋白激酶(Protein Tyrosine Kinases，PTKs)在細胞信號轉導途徑中起到關鍵作用，已成為新型抗腫瘤活性物質的重要靶點。實驗采用激酶抑制劑法對球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的乙酸乙酯、丙酮、正戊醇和水的溶劑萃取物進行檢測，結果顯示，正戊醇萃取物有較明顯的激酶抑制劑活性，抑制率為38.94%;對該萃取物進行薄層層析分離，以丙酮-石油醚(1∶60，v/v)為展開系統，得到Rf值為0.6610的組分，該組分對PTKs具有抑制作用，抑制率為32.21%;對此組分進行硅膠柱層析，以丙酮作為洗脫劑得到的分離組分對PTKs具有強烈的抑制作用，抑制率為86.09%，該組分同時顯示出較強的細胞毒活性，這個結果預示著該組分可能是球等鞭金藻中的目的活性物質;同時，激酶抑制劑法較細胞毒活性法方便快捷，靈敏度高，是一種極具潛力的高通量篩選抗腫瘤活性物質的模型。

酪蛋白激酶，激酶抑制劑，球等鞭金藻，抗腫瘤活性物質

1 材料與方法

1.1 實驗材料

酪氨酸激酶活力檢測試劑盒 CHEMICON公司生產;DTT、PMSF、抑酶肽、亮抑酶肽、EDTA、EGTA、NP-40、Hepes、NaVO3、脫氧膽酸鈉 均為Sigma公司產品;其余試劑 均為市售國產分析純產品;球等鞭金藻(Isochrysis galbana)藻種 來自天津商業大學實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 球等鞭金藻的培養 按10%(v/v)的接種量將處于對數生長期的藻種接入F/2培養基［7］中。培養條件:溫度(20±5)℃;光照強度(6000±500)ux，光照周期為光/暗=12h/12h;每天搖瓶3～5次。

1.2.2 球等鞭金藻藻粉的制備 取對數生長期的藻液，4500r/min離心15min，棄上清，用蒸餾水洗滌藻泥，重復洗滌三次，收集藻泥，真空冷凍干燥成藻粉，4℃保存備用。

1.2.3 球等鞭金藻中活性物質的提取

1.2.3.1 微藻脂溶性物質的提取 分別用乙酸乙酯、丙酮和正戊醇進行萃取。取100g藻粉與適量有機溶劑(1∶6，w/v)混勻，研磨15min，移入分液漏斗中，靜置24h，收集上層萃取液，重復萃取2次，合并萃取液，濃縮至10mL，用0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存備用。

1.2.3.2 微藻水溶性物質的提取 取100mL藻液按1.2.2所述，收集藻泥，用0.01mol/L PBS(pH 7.4)洗滌兩次后，制成密度為106的細胞懸浮液，超聲破碎10min(破碎條件:超聲功率400W，冰浴，間歇破碎，周期為破碎3s，間歇3s)，透析除鹽，濃縮至2mL，用0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存備用。

1.2.4 球等鞭金藻中活性物質的分離 對1.2.3中各溶劑萃取物進行活性檢測，將有活性的萃取物用GF-254硅膠薄板層析進行分離。展開系統為丙酮-石油醚(1∶60，v/v)，層析結束后，在紫外燈下觀察，計算各展開組分的Rf值(有效范圍為:0.3～0.7)，用原溶劑收集各分離組分，3000r/min離心5min，取上清，濃縮至1mL，對各組分進行活性檢測，將有活性的組分4℃保存。

1.2.5 球等鞭金藻中活性物質的純化 用硅膠柱層析對薄層層析分離得到的活性組分進行純化。選用100～200目的硅膠，色譜柱規格為20×300mm，流動相按照極性從大到小依次選用石油醚、丙酮-石油醚(1∶60，v/v)、丙酮-石油醚(1∶30，v/v)、丙酮和無水乙醇，洗脫速度為2mL/min，分別收集各個洗脫液，用旋轉蒸發儀將其蒸干，并將分離組分溶于0.2mL DMSO(0.5%)，4℃保存。

1.2.6 PTKs粗提物的提取 根據酪氨酸激酶活力檢測試劑盒說明書提供的方法提取。將豬肝與預冷的溶解緩沖液混合(1∶4，w/v)置于勻漿機中勻漿，4℃，12000r/min離心10min，取上清，即為PTKs粗提物，-70℃分裝保存備用。

1.2.7 PTKs粗提物蛋白濃度的檢測 用Folin-酚法檢測PTKs粗提物的蛋白濃度。將1mL PTKs粗提物用蒸餾水稀釋10倍，向其中加入福林酚甲液5mL，室溫反應10min，再加入福林酚乙液0.5mL，30℃反應30min，測OD500nm。

1.2.8 PTKs粗提物酶活力的檢測 根據酪氨酸激酶活力檢測試劑盒提供的酶活力標準曲線制作的反應條件檢測PTKs粗提物的酶活力及最適反應蛋白濃度。首先將1mL PTKs粗提物稀釋成4個濃度梯度，然后取不同濃度的PTKs粗提物、酪氨酸激酶活力檢測試劑盒底物、酪氨酸激酶活力檢測試劑盒緩沖液(以下分別簡稱為PTKs、底物、緩沖液)和雙蒸水各10μL混合，制成待檢測樣品反應試劑混合物，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規方法進行操作，至酶反應結束，用酶標儀迅速讀取該反應試劑混合物OD450nm。

1.2.9 球等鞭金藻分離物的抗PTKs活性檢測 根據酪氨酸激酶活力檢測試劑盒的常規方法操作。將待測樣品、適當蛋白濃度的PTKs、底物、緩沖液各10μL混合，制成待檢測樣品反應試劑混合物，同時制備陰性對照反應試劑混合物(底物和緩沖液各10μL、雙蒸水20μL)，酶促反應試劑混合物(底物、緩沖液和PTKs各10μL、雙蒸水10μL)和溶劑對照反應試劑混合物(底物、緩沖液和PTKs各10μL、與待測樣品相同的有機溶劑或除鹽的 F/2培養基10μL)，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規方法進行操作，至酶反應結束，用酶標儀迅速讀取該反應試劑混合物的OD450nm。

1.3 數據處理

2 結果與分析

測定各反應孔的OD450nm，通過比較抑制率的大小，判斷各微藻分離組分對PTKs的酶促反應是否有抑制作用，進而可推斷分離組分是否可能具有抗腫瘤活性。抑制率越大，則微藻分離組分對PTKs的酶促反應的抑制作用越強。其中:

2.1 PTKs粗提物的酶活力測定

由Folin-酚法測得1.2.6中提取的PTKs粗提物的蛋白濃度為13.5mg/mL，將此PTKs粗提物稀釋成4個不同濃度，進行PTKs酶活力測定，結果見表1。由酪氨酸激酶活力試劑盒提供的PTKs酶活力標準曲線得濃度為1.35mg/mL的PTKs粗提物(OD450nm為0.392，介于有效范圍 0.3～0.8之間)的酶活力為0.412U。

表1 PTKs粗提物酶活力檢測結果

2.2 球等鞭金藻分離物對PTKs活性的影響

2.2.1 球等鞭金藻不同溶劑萃取物對PTKs活性的影響 用乙酸乙酯、丙酮、正戊醇和水對球等鞭金藻活性物質進行萃取，檢測得到的不同溶劑萃取物對PTKs酶促反應的影響，實驗結果見表2。

表2 球等鞭金藻的不同溶劑萃取物對PTKs活性的影響

表2中數據顯示，用乙酸乙酯、丙酮、正戊醇和水萃取得到的4種萃取物中，除水溶性物質對PTKs活性無明顯影響外，其余3種對PTKs活性都有不同程度的影響，且以正戊醇萃取物的抑制效果最明顯，其抑制率為38.94%，所以可對此萃取物進一步分離純化，以便進行活性跟蹤。

2.2.2 球等鞭金藻活性物質薄層層析分離組分對PTKs活性的影響 將球等鞭金藻正戊醇萃取物進行薄層層析，采用丙酮-石油醚(1∶60，v/v)作為展開系統，分離得到3個組分，其Rf值分別為0.9068、0.6610和0.6186。檢測這3個組分對PTKs反應活性的影響，結果見表3。

表3 球等鞭金藻的薄層層析分離組分對PTKs活性的影響

表3中數據顯示，薄層層析分離得到的3個組分中，僅有Rf值為0.6610的分離組分對PTKs酶促反應具有較明顯的抑制作用，其抑制率為32.21%，所以可對此組分再次分離純化，以篩選抗腫瘤活性物質。

2.2.3 球等鞭金藻活性物質柱層析分離組分對PTKs活性的影響 將薄層層析得到的Rf值為0.6610的分離組分進行硅膠柱層析，流動相按極性從大到小依次選用石油醚、丙酮-石油醚(1∶60，v/v)、丙酮-石油醚(1∶30，v/v)、丙酮和無水乙醇，先后洗脫得到5個洗脫組分，對這5個洗脫組分進行抗PTKs活性檢測，實驗結果見表4。

通過實驗得到，PTKs酶促反應活力的平均OD450nm為0.841，而乙酸乙酯、丙酮、正戊醇和水對酶促反應的影響不盡相同，其 OD450nm分別為 0.879、0.808、1.217和0.744，可見不同溶劑對酶促反應具有不同程度的影響，甚至對酶促反應具有促進作用(如正戊醇)，嚴重影響到對待測樣品的檢測結果，從而造成活性物質的漏篩或錯篩，所以選用合適的溶劑對篩選模型的建立非常重要，所以本次實驗將分離組分的溶劑換成0.5%(v/v)DMSO［8］。

表4中數據顯示，柱層析得到的5個洗脫組分中，除丙酮-石油醚(1∶60，v/v)洗脫組分對PTKs酶促反應無明顯影響外，其余4個洗脫組分都具有不同程度的抗PTKs活性，其中以丙酮洗脫組分的活性最為強烈，其抑制率為86.09%。所以，可判斷此組分具有潛在的抗腫瘤活性。

表4 球等鞭金藻的柱層析分離組分對PTKs活性的影響

3 結論與討論

本研究采用CHEMICON公司的酪氨酸激酶活力檢測試劑盒對球等鞭金藻的分離組分進行抗PTKs活性跟蹤，實驗結果顯示，用乙酸乙酯、丙酮、正戊醇和水對球等鞭金藻的胞內物質進行萃取，得到4種萃取物，除水溶性物質對PTKs活性無明顯影響外，其他3種萃取物對PTKs活性具有不同程度的抑制作用，并且以正戊醇萃取物的抑制作用最強，其抑制率為38.94%(見表2);用GF-254硅膠薄板層析法對正戊醇萃取物進行分離，以丙酮-石油醚(1∶60，v/v)為展開劑，得到3種分離組分，其Rf值分別為0.9068、0.6610和0.6186，其中Rf值為0.6610的分離組分對 PTKs活性具有明顯影響，其抑制率為32.21%(見表3);為使此活性組分得到進一步分離純化，本實驗對其進行了硅膠柱層析，依次用石油醚、丙酮-石油醚(1∶60，v/v)、丙酮-石油醚(1∶30，v/v)、丙酮和無水乙醇作為流動相進行洗脫，得到5個分離組分，除丙酮-石油醚(1∶60，v/v)洗脫組分以外，其余4個組分對PTKs活性具有不同程度的影響，其中丙酮洗脫組分的抑制效果極為明顯，其抑制率為86.09%(見表4)。

上述研究結果表明，球等鞭金藻活性物質成分對PTKs活性的有效抑制范圍為32.21%～86.09%。在本課題的前期研究中，噻唑藍(MTT)比色法實驗結果顯示:市售抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶和球等鞭金藻活性物質成分對Hela細胞的有效抑制率范圍分別為42%～56%和33.96%～96.21%，說明球等鞭金藻活性物質對PTKs活性的影響與MTT實驗結果一致。另外，新型多靶向性腫瘤治療藥物舒尼替尼的臨床實驗結果表明，舒尼替尼不僅可以抑制腫瘤生長的活性，還具有促使腫瘤衰退的活性［9-11］，其收益率為70%～75%［12-14］;鄭銳［15］等研究發現，口服Src酪氨酸激酶抑制劑對A549細胞誘導下的皮下腫瘤細胞的有效抑制率維持在39.4%，與本研究結果相比，球等鞭金藻活性物質對PTKs具有更高的靶向抑制活性。因此，球等鞭金藻活性物質不僅能夠有效抑制腫瘤細胞生長，并且可用于開發PTKs靶向性腫瘤治療藥物。

生物活性物質的篩選通常從兩方面入手，一是有目的地尋找某種或某類已知的化合物;二是尋找具有某種生理活性的成分。傳統的藥物篩選方法是采用藥理學方法，通過體內、體外多種檢測，評價藥用樣品的藥理活性。由于傳統的藥理學方法不但要消耗大量樣品，而且對技術人員的操作技能要求較高，同時受到靈敏度和篩選通量的限制，不適合同時篩選大量樣品。高通量篩選模型是以傳統的篩選技術為基礎，應用先進的分子生物學、細胞生物學、計算機、自動化控制等高新技術，建立的一套更適合于藥物篩選的技術體系，能夠在同一時間內對數千、萬計的樣品進行檢測，并以相應的數據庫支持整個技術體系的正常運轉［16］，因此，高通量篩選模型已逐漸替代傳統藥物篩選模型，被人們廣泛應用于活性物質篩選。

高通量篩選技術與傳統的藥物篩選方法相比，有反應體積小、自動化程度高、靈敏度高、高度特異性等特點，尤其是基于已知作用靶點或藥物作用機制的新藥研究，高通量篩選更是顯示了強大的優勢，而且可以評價藥物的代謝過程以及毒性作用，目前已經建立了比較成熟的高通量篩選模型［17-18］。但應用高通量篩選方法發現創新藥物，也存在許多尚未解決的問題，如體外模型的篩選結果與整體藥理作用的關系，對藥物高通量篩選模型的評價標準，篩選模型的新穎性和實用性的統一，以及新的藥物作用靶點的研究和發現等［19］，仍然是目前藥物篩選領域研究的重要課題。

本研究建立了一個方便快捷的靶向性抗腫瘤活性物質的體外篩選模型，并成功地篩選到了對PTKs有明顯抑制作用的球等鞭金藻活性物質組分，為深化研究球等鞭金藻中的靶向性抗腫瘤活性物質提供了實驗基礎。

［1］劉全永，胡江春，薛德林，等.海洋微生物生物活性物質研究［J］.應用生態學報，2002，13(7):901-905.

［2］Kammasud N，Boonyarat C，Tsunoda S，et al.Novel inhibitor for fibroblast growth factor receptor tyrosine kinase［J］.Bioor Med Chem Lett，2007，17(17):4812-4818.

［3］Li M，Babenko N A，Sakaguchi D S.Inhibition of protein tyrosine kinase activity disrupts early retinal development［J］.Dev Biol，2004，266(1):209-221.

［4］胥彬，丁健.腫瘤藥理學新論［M］.上海:人民衛生出版社，2003:112-113.

［5］Fabbro D，Parkinson D，Matter A.Protein tyrosine kinase inhibitous:new treatment modalities［J］.Curr Opin Pharmacol，2002，2:374-381.

［6］韓錦華，王雪青，苗惠.三種海洋微藻抗腫瘤活性的研究［J］.天津科技大學學報，2006，21(4):25-28.

［7］陳明耀.生物餌料培養［M］.北京:中國農業出版社，2001，5:27-33.

［8］張勇二.甲基亞砜的合成及在保健食品和醫藥中的應用［J］.廣州食品工業科技，2004，20(2):136-139.

［9］Mendell B D，Laird A D，Xin X H，et al.In vivo antitumor activity of SU11248，a novel tyrosine kinase inhibitor targenting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors［J］.Clin Cancer Res，2003(9):327-337.

［10］Abrams T J，Lee L B，Murray L J，et al.SU11248 inhibits KIT and platelet-deribed growth factor receptor β in preclinical models of human small cell lung cancer［J］.Mol Cancer Ther，2003，5(2):471-478.

［11］Chow L Q，Eckhardt S G.Sunitinib:from rational design to clinical efficacy［J］.J Clin Oncol，2007，25(7):884-896.

［12］Motzer R J，Rini B I，Michaelson M D，et al.Phase 2 trials of SU11248 show antitumor activity in second-line therapy for patients with metastatce renal cell carcinoma(RCC)［J］.J Clin Oncol，2005，23(16 Suppl):4508.

［13］Motzer R J，Michaelson M D，Redman BG，et al.Activity of SU11248，a multitargeted inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor and platelet-derived growth factor receptor，in patients with metastatic renal cell carcinoma［J］.J Clin Oncol，2006，24(1):16-24.

［14］沐雨.舒尼替尼(索坦)中國上市會暨第三屆輝瑞腫瘤論壇報道［N］.中國醫學論壇，2008-6-12(B04).

［15］鄭銳，秦曉松，矢野圣二，等.抑制Src酪氨酸激酶對非小細胞肺癌細胞增殖的影響［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13 (11):826-830.

［16］Ivanov I，Schaab C，Planitzer S，et al.DNA microarray technology and antimicrobial drug discovery［J］.Pharmacogenomics J，2000，1(2):169-178.

［17］Balimane P V，Chong S，Morrison R A.Current methodologies used for evaluation of interstinal permeability and absorption［J］.J Pharmacol Toxicol，2000，44(1):301-312.

［18］Shibata Y，Takahashi H，Ishii Y.A convenient in vitro screening method for predicting in vivo drug metabolic clearance using isolated hepatocytes suspended in serum［J］.Drug Metab Dispos，2000，28(12):1518-1523.

［19］Swinney D C.Targeting protein ubiquityination for drug discovery.What is in the drug discovery toolbox?［J］.Drug Discovery Today，2001，6(5):244-250.

Screening of anti-tumor active substances from Isochrysis Galbana by the method of kinase inhibitors

GUO Xiao-xue，WANG Xue-qing*，WANG Ying，ZHAO Pei
(Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China)

Protein tyrosine kinases(PTKs)plays an important role in signal transduction pathways，which had become the interesting targets of screening new antitumor bioactive substances.The activity of PTKs of the fractions extracted from Isochrysis Galbana by ethyl acetate，acetone，pentyl alcohol and water were conducted respectively，for screening effective PTKs inhibitors to develop the leading compounds of antitumor drugs.The result showed the pentyl alcohol extract of Isochrysis Galbana had obvious inhibition on PTKs in treated samples，which inhibition rate was 38.94%.And the isolated component that the value of Rfwas 0.6610 from the pentyl alcohol extract by thin-layer chromatography used acetone-petroleum ether(1∶60，v/v)as developer，had inhibition on PTKs，and inhibition rate was 32.21%.Furthermore，by means of silica gel column chromatography which acetone was used for eluent，the acetone elution part from the former component exhibited the strongest inhibition against PTKs，and inhibition rate was 86.09%.Moreover，the substance also represented strong cytotoxin active.Therefore，it would be the aim active substances of Isochrysis Galbana.Meanwhile，the method of kinase inhibitors is more convenient and sensitive in operation than that of cytotoxin active，and it is an attractively potential model of high throughput screening anti-tumour activity substances.

protein tyrosine kinases(PTKs);kinase inhibitors;Isochrysis Galbana;anti-tumour bioactive substances

TS201.1

A

1002-0306(2011)03-0142-04

細胞毒活性是一種常用來描述生物提取物藥理活性的指標［1］，由于細胞毒活性檢測受到靈敏度和篩選通量的限制，以及細胞毒類藥物一般都有選擇性差、毒副作用強、易產生耐藥性等缺點，使得將能夠調控細胞信號通路的關鍵酶作為藥物篩選的靶點，成為抗腫瘤藥物研究開發的重要方向。酪蛋白激酶(Protein Tyrosine Kinases，PTKs)是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質，可分為受體型［2］和非受體型［3］兩種，它們能催化ATP上的磷酸基轉移到許多重要蛋白質的酪氨酸殘基上，使其發生磷酸化，從而調節細胞生長、分化、死亡等一系列生理過程［4］，PTKs的功能失調則會引發生物體內的一系列疾病。原癌基因和類癌基因的異常表達會引起細胞增殖紊亂，進而導致腫瘤發生。已有資料［5］表明，超過50%的原癌基因和癌基因產物具有PTKs活性，因此，以PTKs作為篩選靶點已成為新型抗腫瘤藥物篩選模型。球等鞭金藻(Isochrysis galbana)是一種廣泛存在的微型海洋浮游單細胞藻類，有研究發現［6］，球等鞭金藻的有機溶劑萃取物對腫瘤細胞Hela和A549有明顯的細胞毒活性，本研究將PTKs作為篩選靶點，對球等鞭金藻的分離組分進行活性跟蹤，旨在篩選出具有PTKs抑制劑活性的新物質，并建立一種高通量藥物篩選模型。

2010-07-19 *通訊聯系人

郭曉雪(1985-)，女，在讀碩士研究生，研究方向:天然活性物質的研究與開發。

天津市科委應用基礎重點項目(08JCZDJC16600);天津市科技攻關項目(06YFGZNC04200)。