甘蔗葉黃酮分離純化工藝及生理活性研究

閻欲曉，黃 玥

(廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530005)

甘蔗葉黃酮分離純化工藝及生理活性研究

閻欲曉，黃 玥

(廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530005)

實驗以甘蔗葉為原料，研究黃酮類化合物分離純化工藝，并研究甘蔗葉黃酮對羥自由基(·OH)、超氧自由基(O2-·)和亞硝酸鹽(NO2-)的清除能力。結果表明，利用超聲波輔助提取，甘蔗葉黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度80%，提取溫度60℃，超聲提取時間60min，料液比1∶40，超聲波功率為104W，該工藝制備得到的甘蔗葉黃酮提取量為22.13mg/g。甘蔗葉黃酮粗提物對自由基和亞硝酸鹽均具有較強的清除作用。采用AB-8大孔樹脂進行純化，純化條件為上樣濃度1.9mg/mL，上樣流速1mL/min，流量為3BV的70%乙醇洗脫。

甘蔗葉，黃酮，超聲波，生理活性，大孔樹脂，分離純化

1 材料與方法

1.1 材料與設備

甘蔗葉 采集于廣西大學農學院甘蔗種植田，烘干粉碎備用;蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所;氫氧化鈉、無水乙醇、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、焦性沒食子酸、硫酸亞鐵、鄰菲啰啉、無水對氨基苯磺酸、N-1-苯基乙二胺 均為分析純;AB-8樹脂上海摩速科學器材有限公司。

數顯恒溫水浴鍋，UV-1240紫外分光光度計，SONICS超聲波破碎儀(功率130W)，旋轉蒸發儀，層析柱等。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮含量的檢測方法 準確稱取蘆丁0.0200g，用50%乙醇溶解定容至100mL，搖勻，制備成0.2000mg/mL的標準溶液，裝入棕色瓶中，備用。取蘆丁標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分別置于25mL容量瓶中，各加50%乙醇稀釋至6mL，各加5%亞硝酸鈉1mL，混勻，放置6min。加入10%硝酸鋁1mL，搖勻，再放置6min，加入5%氫氧化鈉10mL，最后用50%乙醇溶液定容到 25mL，靜置15min，以相應試劑為空白，在510nm的波長處測吸光度A，以吸光度為縱坐標，濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為:y=12.304x-0.0019，R2=0.9993。精確吸取提取一定量待用的樣液于25mL的容量瓶中，以下操作同標準曲線的制作。根據吸光度和回歸方程計算黃酮含量并依據以下公式計算樣品總黃酮提取量。

樣品中黃酮含量率(mg/g)=標準曲線中計算樣品濃度值×25×樣品總體積(mL)/原料干重(g)×取樣體積(mL)

1.2.2 甘蔗葉總黃酮提取條件的優化 采用超聲波輔助提取工藝，在單因素實驗的基礎上，著重考察乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、超聲時間(C)、料液比(D)對甘蔗葉黃酮提取效率的影響。選用L9(34)正交實驗設計，對甘蔗葉總黃酮提取工藝進行優化。

表1 正交實驗因素水平表L9(34)

1.2.3 甘蔗葉生理活性的研究

1.2.3.1 清除羥自由基(·OH) 利用Fenton反應檢測對羥基自由基的清除作用。取1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲-無水乙醇溶液于試管中，依次加入2mL 0.15mol/L的磷酸緩沖液(PBS，pH=7.40)和1mL蒸餾水，充分搖勻，再加入1mL 0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液(FeSO4)，混勻后加入 1mL 0.01%雙氧水(H2O2)，置于37℃水浴保溫60min，然后在536nm測定吸光值，所得數據為損傷管的吸光值A損傷。以1mL蒸餾水代替損傷管中的1mL 0.01%雙氧水(H2O2)，操作方法同損傷管，可測得未損傷管的吸光值A空白。取不同體積的樣品代替損傷管中的蒸餾水，操作方法同損傷管，可測得反應體系中不同濃度的黃酮樣品的吸光值A樣品。

1.2.3.2 清除超氧陰離子自由基(O2-·) 取4.5mL pH8.34的50mmol/L的PBS，4.2mL的蒸餾水，混勻后在25℃的水浴中保溫20min，取出后立即加入在25℃預熱的4mmol/L鄰苯三酚0.3mL，使溶液的總體積達到9.0mL，測反應啟動后30s到3min的A325，計算斜率，為K自氧。

待測液取試劑前，只是在加入鄰苯三酚前分別加入不同體積的樣品液，蒸餾水減少相應的體積，同時作樣品空白以消除樣品本身顏色的影響，測定反應體系中不同濃度的黃酮樣品反應啟動后30s到3min的A325，計算斜率，為K樣品。

1.2.3.3 清除亞硝酸鹽(NO-2) 取三支25mL的刻度試管a、b、c，準確稱取1mL的5μg/mL的NaNO2溶液兩份分別加入到a管和c管中，然后吸取一定量的樣液，分別加入a管和b管中，反應20min后，a、b、c管中分別加入0.4%的對氨基苯磺酸1.0mL，搖勻反應5min后，再都加入0.2%的N-1-萘乙二胺鹽酸鹽0.5mL，最后用蒸餾水補充到25mL搖勻靜置15min，在最大吸收波長540nm處，以b管為參比管測得a管的吸光度A，以試劑空白為參比測得c管的吸光度為A0。

1.2.4 甘蔗葉總黃酮大孔吸附樹脂純化工藝

1.2.4.1 樣液制備 取一定量甘蔗葉以80%乙醇作為提取劑，料液比為1∶40，在水浴溫度60℃、超聲功率為104W的條件下超聲波提取60min，減壓抽濾，得到甘蔗葉黃酮粗提物的醇溶液。將得到的醇溶液旋轉蒸發除去醇，然后過濾，去除雜質，得到甘蔗葉黃酮的待純化液，備用。

1.2.4.2 大孔樹脂預處理 取適量樹脂，用體積分數為95%的乙醇浸泡24h，濕法裝柱，用乙醇洗滌至流出的液體與5BV(樹脂床體積)蒸餾水混合不顯白色渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味，然后用5%HCl溶液浸泡2h，用蒸餾水洗至中性;最后用5%NaOH溶液浸泡2h，再用蒸餾水洗至中性，備用。

1.2.4.3 原液濃度對吸附量的影響 取13g樹脂裝柱，柱床體積為20mL。取濃度不同質量相同的原液，濃度為0.6mg/mL的240mL、濃度為0.9mg/mL的160mL、濃度為1.9mg/mL的76mL、濃度為2.6mg/mL的55mL，1mL/min流速分別上樣進行動態吸附，以總黃酮吸附量為考察指標。

吸附量(mg黃酮/g樹脂)=［原料液體積×(吸附前濃度-吸附后濃度)］/樹脂量

吸附率(%)=［原料液體積×(吸附前濃度-吸附后濃度)］/(原料液體積×吸附前濃度)×100%

1.2.4.4 上樣速度對吸附量的影響 同上裝柱，取1.9mg/mL原樣液76mL，分別以0.5、1、1.5mL/min流速上樣，進行動態吸附，考察上樣流速對吸附效果的影響。

1.2.4.5 洗脫劑濃度及洗脫體積的選擇 將1.9mg/mL上樣液80mL，以1mL/min流速分別通過四根層析柱進行動態吸附。各用30%、50%、70%、90%的4種濃度的乙醇以1mL/min流速洗脫，分段收集洗脫液，每份5mL，以洗脫液總黃酮含量為考察指標，繪制洗脫曲線并計算洗脫率。

洗脫率(%)=(洗脫液黃酮濃度×洗脫液體積)/吸附量×100%

2 結果與討論

2.1 甘蔗葉中總黃酮提取工藝優化

正交實驗因素水平表見表1。正交實驗結果見表2。從表2的極差分析可以看出，4種因素對提取效果影響大小依次為:乙醇濃度＞超聲時間＞提取溫度＞料液比。方差分析見表3，結果與極差分析一致，即乙醇濃度影響顯著，對結果影響最大。超聲時間和提取溫度及料液比影響不顯著，因此從節約成本提高效率等因素綜合考慮，最佳工藝條件為乙醇濃度為80%，提取溫度60℃，超聲提取時間為60min，料液比1∶40，超聲波功率為104W。該工藝制備得到甘蔗葉黃酮含量為22.13mg/g，比正交實驗的9組都高。比9組中最高組較為偏高的原因可能是在做驗證實驗時原料已是殘余底料，原料有些不均勻所致。

表2 正交實驗設計及極差分析結果

表3 正交實驗方差分析

2.2 甘蔗葉黃酮生理活性研究

2.2.1 清除羥自由基作用 由圖1可知，甘蔗葉黃酮對羥自由基具有較強的清除作用，而且羥自由基清除率隨著黃酮質量濃度的提高而增大。甘蔗葉黃酮清除羥自由基的IC50(清除率為50%時的濃度)為0.038mg/mL，而抗壞血酸清除羥自由基的 IC50為0.042mg/mL，表明甘蔗葉黃酮清除羥自由基的能力高于抗壞血酸。

2.2.2 清除超氧自由基的作用 由圖2可知，甘蔗葉黃酮對超氧自由基有一定的清除能力，清除率在一定范圍內與黃酮濃度呈正相關性，甘蔗葉黃酮清除超氧陰離子的IC50為0.092mg/mL，而抗壞血酸清除超氧陰離子的IC50為0.04mg/mL。表明甘蔗葉黃酮對超氧陰離子具有一定的清除作用，但作用效果低于同濃度下抗壞血酸的清除能力。

圖1 黃酮粗提液對羥自由基的清除作用

圖2 黃酮粗提液對超氧陰離子的清除作用

2.2.3 清除亞硝酸鹽的作用 由圖3可知，反應體系中隨著甘蔗葉黃酮含量的增加，對亞硝酸根離子的清除率呈現上升的趨勢。甘蔗葉黃酮清除亞硝酸根的IC50為0.12mg/mL，而抗壞血酸清除亞硝酸根的IC50為0.037mg/mL。表明甘蔗葉黃酮對亞硝酸鹽具有一定的清除作用，但作用不及抗壞血酸。

圖3 黃酮粗提液對亞硝酸鹽的清除作用

2.3 AB-8大孔樹脂分離純化工藝的研究

2.3.1 上樣液濃度對吸附量的影響 實驗結果見表4。由表 4可看出，在低濃度范圍，樣液濃度由0.6mg/mL增加至1.9mg/mL時，隨著上樣液濃度的增大，吸附量隨之增加。但繼續增加樣液濃度至2.6mg/mL時吸附量反而下降了，原因是上樣液濃度太大，被吸附物質在樹脂內部擴散速度變慢，在一定流速下，導致吸附能力下降，所以選擇1.9mg/mL有利于吸附。

表4 上樣液濃度對吸附量的影響

2.3.2 上樣速度對吸附量的影響 由表5看出，流速為0.5mL/min和1mL/min時，甘蔗葉粗提液通過樹脂較緩慢，和樹脂接觸充分，能更好地吸附在樹脂上，吸附率較高。當流速為1.5mL/min時，溶質分子來不及擴散吸附到樹脂的表面，使吸附率下降，所以選擇1mL/min的上樣流速為宜。

表5 上樣速度對吸附量的影響

2.3.3 洗脫劑用量及洗脫濃度的選擇 由圖4可知，用70%和90%的乙醇洗脫效果較好，洗脫曲線峰形窄，對稱性好，無拖尾現象。由表6可知，70%和90%的乙醇洗脫率都達到了80%以上，而且70%乙醇的洗脫率比90%乙醇更高，故選擇70%的乙醇洗脫。而且由圖4中70%乙醇的洗脫曲線可知，當洗脫劑用量達到60mL(3BV左右)時，洗脫液中黃酮含量已經接近于零，可認為黃酮已經基本洗脫完全，此時可以停止洗脫。

圖4 不同濃度乙醇洗脫劑的洗脫曲線

表6 洗脫劑濃度對洗脫率的影響

3 結論

3.1 利用超聲波輔助提取，影響甘蔗葉黃酮化合物浸出的影響因素大小為乙醇濃度＞超聲時間＞提取溫度＞料液比。甘蔗葉中黃酮最佳提取工藝為:乙醇濃度為 80%，提取溫度 60℃，超聲提取時間60min，料液比1∶40，超聲波功率為104W。

3.2 對甘蔗葉黃酮粗提物進行活性研究表明，甘蔗葉黃酮對羥自由基、超氧自由基和亞硝酸根都具有清除能力。

3.3 甘蔗葉黃酮純化條件為:AB-8大孔樹脂，上樣濃度為1.9mg/mL，上樣流速為1mL/min，體積為3BV的70%乙醇具有良好的洗脫能力。

［1］保國裕.從甘蔗中提取若干保健品的探討［J］.甘蔗糖業，2003(2):41-44.

［2］鄧家剛，侯小濤，李愛媛，等.甘蔗葉的藥效學初步研究［J］.廣西中醫學院學報，2008，11(3):77-79.

［3］侯小濤，鄧家剛，馬建鳳，等.甘蔗葉提取物的體外抑菌作用研究［J］.華西藥學雜志，2010，25(2):161-163.

［4］鄧家剛，郭宏偉，侯小濤.甘蔗葉提取物的體外抗腫瘤活性研究［J］.遼寧中醫雜志，2010，37(1):32-34.

［5］吳建中，歐仕益，汪勇.甘蔗葉中黃酮類物質的提取及抗氧化性研究［J］.現代食品科技，2009，25(2):165-167.

Extraction，purification and physiological activities of total flavonoids from sugar cane leaves

YAN Yu-xiao，HUANG Yue
(College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China)

Total flavonoids were extracted from sugar cane leaves using ethanol and purified using macroporous adsorption resin.Additionally，the scavenging ability to·OH，O2-· and NO2-were evaluated for the extract product.The results showed that the optimum conditions of extraction were:ethanol concentration 80%，material/ liquid 1∶40，ultrasonic wave extraction 60min at 60℃，ultrasonic power 104W.Under such condition，the extraction of flavonoids from sugarcane leaves was 22.13mg/g.The crude extract product displayed a good scavenging activity to·OH，O2-·and NO2-.The properties of AB-8 resin was good for absorption and desorption of total flavonoids. The optimal purification parameters were as follows:sample concentration 1.9mg/mL，the current velocity 1.0mL/min，taking 70%ethanol as eluent，and eluent quantity 3BV.

sugar cane leaves;flavonoids;ultrasonic wave;physiological avtivities;macroporous resin;extraction and purification

TS255.1

B

1002-0306(2011)03-0149-04

甘蔗(Saccharum sinensis Roxb.)為禾本科植物的莖桿，廣植于溫帶及熱帶地區，我國南方各省均有栽培。甘蔗葉為甘蔗收獲后的副產品，產量很大，每年我國南方各省大量的甘蔗葉并未得到充分利用，除少部分作為動物飼料外，大部分被蔗農就地焚燒，造成資源浪費并嚴重污染環境。甘蔗葉中除含有大量葉綠素外，還含有維生素C、多糖、黃酮、多酚等多種化學成分，分子量為5000以上的多酚類化合物在甘蔗葉占33%，蔗梢占37%［1］。近年的研究表明，蔗葉提取物有抑制血糖升高的作用［2］，有明顯的抑菌作用［3］和體外抗腫瘤作用［4］，采用乙醇回流浸提方法從甘蔗葉中提取出的黃酮物質有較強的抗氧化性能［5］。但甘蔗葉中纖維素物質含量較高，細胞壁結構緊密，采取一般的溶劑萃取法提取率不高，時間長，本研究將超聲技術應用于甘蔗葉活性成分提取中，利用超聲波的空化作用，加速有效成分的浸出，減少提取時間，提高得率;同時對甘蔗葉黃酮提取物進行活性功能的研究;采用AB-8大孔樹脂對甘蔗葉黃酮進行吸附解析實驗，研究適宜的純化工藝，為甘蔗葉資源得到有效利用，變廢為寶提供理論依據和技術支持。

2010-08-09

閻欲曉(1970-)，女，研究生，副教授，研究方向:動植物中活性成分分離及性質研究。

廣西大學科研基金資助項目(XGL090036)。