賴氨酸-葡萄糖美拉德反應產物對銅離子的螯合作用

孫麗平，莊永亮，汪東風

(1.昆明理工大學化學與工程學院食品工程研究中心，云南昆明650224; 2.中國海洋大學食品科學與工程學院食品科學實驗室，山東青島266003)

賴氨酸-葡萄糖美拉德反應產物對銅離子的螯合作用

孫麗平1，莊永亮1，汪東風2

(1.昆明理工大學化學與工程學院食品工程研究中心，云南昆明650224; 2.中國海洋大學食品科學與工程學院食品科學實驗室，山東青島266003)

美拉德反應產物(Maillard reaction products，MRPs)具有抗氧化活性，特別是金屬螯合作用。本文制備了一定條件下的賴氨酸-葡萄糖MRPs，采用零交一階導數分光光度法研究了MRPs對銅離子的螯合作用，分析了螯合銅離子對MRPs抗氧化活性的影響。結果表明，螯合銅離子使MRPs中具有紫外光吸收的小分子物質發生電子重排，不影響大分子黑素類物質的發色團結構;一些銅螯合位點對MRPs的還原能力和自由基清除能力有貢獻。

美拉德反應，抗氧化，金屬螯合，一階導數分光光度法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-葡萄糖(D-Glucose，Glu)、L-賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine，Lys)、紫尿酸胺(tetramethylmurexide，TMM) 生化試劑;甲醇 色譜級;DPPH· 購自Sigma公司;其他 均為分析純;整個實驗用水 超純水。

UV-2102PC紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯;螺口密封玻璃管(16×160mm) 德國Schott; DKU-3恒溫油槽 上海精宏;Delta 320 pH計 美國梅特勒-托利多。

1.2 Lys-Glu體系MRPs的制備

取0.015mol的Lys和Glu溶于50mL超純水中，用1mol/L的碳酸鈉溶液調節pH為6.68。分裝溶液(5mL)至螺口玻璃管中，充氮氣2min，密封，120℃油浴加熱8h，六個平行，加熱結束，冰水浴迅速冷卻。4℃存放至測試。

表1 MRPs的抗氧化活性及不同濃度的銅離子對其抗氧化能力的影響

MRPs溶液隨加熱時間延長由無色、淺黃色、黃色、橘色、棕色至褐色，澄清透明。原液濃度計為反應物總濃度，即100.8mg/mL，測試時適度稀釋。

1.3 MRPs紫外-可見吸收光譜分析

將MRPs原液用超純水100倍稀釋(1∶100，v/v)，以未加熱樣品為對照，測定溶液198～552nm的吸收光譜。測定參數:1cm雙面石英比色杯，1nm掃描精度，1.8nm光譜通帶寬度，掃描六次。分析樣品在紫外和可見區的特征吸收峰，記錄最大吸收峰波長(λmax)，分析美拉德產物的產生情況。

1.4 MRPs抗氧化活性分析

測定MRPs的還原能力-還原Fe3+→Fe2+的能力［2］、自由基清除能力-DPPH自由基清除活性［2］和銅離子螯合能力-紫尿酸胺雙波長分光光度法［3］。

1.5 零交一階導數分光光度法分析MRPs對銅離子的螯合作用

取20倍稀釋(1∶20，v/v)的MRPs溶液0.5mL于5mL離心管，加入1.5mL Hex緩沖液和0.5mL溶于緩沖液的硫酸銅溶液(0～5mmol/L)，混勻，室溫下放置1h。以同樣處理的未加熱樣品為對照，測定溶液198～552nm的紫外-可見吸收光譜并轉換成一階導數圖譜。

1.6 不同濃度的銅離子對 MRPs抗氧化活性的影響

取用1.5中螯合銅離子后的MRPs溶液，按照1.4方法測定不同銅離子濃度對MRPs抗氧化能力的影響，無銅MRPs的抗氧化能力為對照。

2 結果與討論

美拉德反應是連續的多途徑并行的瀑布式化學過程，通常被分為三個階段:初級階段、高級階段和終級階段［4］。初級階段開始于羰基和氨基縮合、環化、脫水等，產生Amadori/Henys化合物;高級階段Amadori/Henys化合物降解，釋放氨基化合物，羰基化合物降解為鄰酮糖類物質;鄰酮糖類物質裂解和Strecker降解反應［5］產生大量的活性小分子物質;小分子物質自身或相互間聚合，進入終級階段，產生顏色大分子黑素類物質。

2.1 MRPs紫外-可見吸收光譜分析

紫外-可見吸收光譜分析(圖1中譜帶1)表明，MRPs在近紫外區220、294nm和可見光360nm處有特征吸收峰。

美拉德反應高級階段產生的大量活性小分子物質，如酮類和醛類衍生物等［4］，在近紫外區有強吸收。這些小分子物質組成極其復雜，不能一一鑒定分析［6-9］。294nm吸收峰在各種美拉德反應體系中都有報道［2，6-9］。但220nm吸收峰鮮有報道，可能是已有研究直接測定MRPs特定波長(294、360、420nm等)下的吸光值，較少進行光譜掃描。小分子有機酸產物，如甲酸、乙酸等在此波長下有特征吸收，一些酰胺類物質也有吸收;鄰酮糖類物質［5］可能也對220nm吸收峰有貢獻。反應高級階段后，小分子產物聚合到大分子碳骨架上，成為大分子產物的發色團結構，在可見光區360nm產生吸收峰。

圖1 不同銅離子濃度環境中MRPs紫外-可見吸收光譜組合圖注:1:0mmol/L;2:1mmol/L;3:2mmol/L;4:5mmol/L。

2.2 MRPs的抗氧化活性

本實驗條件下的MRPs具有一定的還原能力、自由基清除能力和金屬螯合能力(表1)。美拉德反應中氨基還原酮類產物具有較強的還原能力［4］;反應高級階段產物能夠提供氫原子［10］表現還原能力;從美拉德反應機制角度講［11］，中性條件下主要為電子傳遞機制，使體系表現還原能力。具有供氫和供電子能力的美拉德高級階段產物能夠使DPPH·發生電荷轉移而消除;同時MRPs混合物中的自由基產物也能夠直接與DPPH·結合為穩定物質。MRPs的金屬螯合能力被認為是終級階段大分子黑素類物質的作用［12］，具體機理不清楚。氨基酸［13］和初級階段的西夫堿類［14］是有效的金屬螯合劑，所以反應體系中的未反應的氨基酸和產生的西夫堿等對銅離子應具有螯合作用，這個問題在美拉德反應研究中未見討論。

2.3 零交一階導數分光光度法分析MRPs對銅離子的螯合作用

本實驗條件下的MRPs在不同銅離子濃度環境中的紫外-可見光吸收圖譜組合如圖1所示。隨銅離子濃度增加，220nm最大吸收峰逐漸消失;294nm有輕微的減色效應，大分子黑素類物質的360nm特征峰幾乎沒有變化，表明銅離子與MRPs發生了作用，使MRPs中的一些小分子物質發生電子重排［1］。這說明具有供氫和供電子活性的小分子物質具有螯合銅離子的作用，螯合銅離子后自身發生電子重排，全部或部分損失對光吸收的能力。但銅離子螯合后不影響大分子產物的發色團結構。

MRPs是極其復雜的混合物，一階導數圖譜較零階圖譜更有效地分析銅離子螯合作用。如圖2所示，與零階圖譜的三個特征峰相對應，MRPs的一階導數圖譜具有三個較規則的振幅(圖2A)，分別是D210～230、D270～300和 D340～390，表明本實驗條件下 MRPs混合物是由三類結構不同的物質組成的，而每類物質在結構上較為類似，這可能是體系只有一種糖和氨基酸，產物組成相對比較簡單。與零階圖譜變化規律類似，在不同銅離子濃度環境中，MRPs的一階導數圖譜隨銅離子濃度增加而不斷變化，主要是振幅D210～230消失(圖2B～圖2D)。零交一階導數圖譜分析表明，初始pH為中性，120℃加熱8h的Glu-Lys產物中的小分子物質對金屬螯合有一定的作用，大分子黑素類產物的發色團結構不易被金屬離子影響。

圖2 不同銅離子濃度環境中MRPs紫外-可見吸收光譜一階導數圖譜注:A:0mmol/L;B:1mmol/L;C:2mmol/L;D:5mmol/L。

2.4 不同銅離子濃度對MRPs抗氧化能力的影響

在不同銅離子濃度環境中MRPs的還原能力和DPPH·清除能力明顯降低，但是下降趨勢不同，還原能力一直下降至對照樣品的55%左右，而DPPH·清除能力先下降至對照的66%左右，然后隨銅濃度的增加上升至對照的73%左右，這個現象在美拉德反應研究中未見報道。上述零交一階導數圖譜分析表明MRPs螯合銅離子后，一些活性小分子物質發生電荷重排，可能失去供氫和供電子能力，使還原力和自由基清除能力損失，說明一些銅螯合位點對這兩方面的抗氧化作用是有貢獻的。

3 結論

初始pH6.68，120℃加熱8h后的Lys-Glu美拉德反應產物在還原能力、自由基清除能力和金屬螯合三個方面都有效果;零交一階導數圖譜分析表明，MRPs中的小分子物質對螯合銅離子有一定的作用，螯合銅離子后自身發生電子重排;大分子黑素類產物的發色團結構不受銅離子影響;螯合銅離子后MRPs還原能力和自由基清除能力下降，說明一些銅離子螯合位點對MRPs的還原能力和自由基清除能力有貢獻。

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Study on Cu2+-chelating function of Maillard reaction products from lysine-glucose model system

SUN Li-ping1，ZHUANG Yong-liang1，WANG Dong-feng2
(1.Research Center of Food Engineering，College of Chemistry and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650224，China;2.The Laboratory of Food Science，College of Food Science and Technology，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

The antioxidant activity of MRPs from lysine-glucose model system was investigated，especially its Cu2+-chelating function by zero-crossing first-derivative spectrophotometry was studied.The results showed that Cu2+-chelating to MRPs made the electronic rearrangement in low molecular weight intermediates，and partly destroyed the reducing power and DPPH-scavenging ability.The results indicated that the antioxidant properties of MRPs were a result of multiple mechanisms，and Cu2+-binding sites had reducing power or DPPH·scavenging ability.

Maillard reaction;antioxidant activity;metal-chelating effect;first derivative spectrophotometry

TS201.2

A

1002-0306(2011)03-0169-03

MRPs被認為是具有抗氧化活性的天然產物，能夠延緩脂質氧化、抑制多酚的酶促褐變等。美拉德反應過程非常復雜，MRPs是混合物，產物組成和性質因反應條件而有較大的差異，抗氧化效果是混合物的綜合表現。目前對于MRPs的抗氧化機理報道較少，而MRPs對金屬離子具有螯合作用被認為是其抗氧化機理之一［1］。賴氨酸對美拉德反應最為敏感，葡萄糖是食品加工和生物體中最常見的還原糖，賴氨酸-葡萄糖美拉德反應產物普遍存在，研究其抗氧化效果和金屬螯合作用是很有意義的。為此，本文制備了一定條件下的賴氨酸-葡萄糖MRPs，測定了其抗氧化效果，利用零交一階導數分光光度法研究了MRPs對銅離子的螯合作用，分析了不同銅離子濃度對抗氧化效果的影響，以期為MRPs的抗氧化機理及對微量金屬元素吸收利用的影響等研究提供資料。

2010-02-25

孫麗平(1981-)，女，博士，講師，研究方向:食品安全與營養。