響應面法優化微量熱法檢測用菌體培養基的實驗研究

徐 斐，農衛良，管 驍，秦旭銳，石服鑫

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093)

響應面法優化微量熱法檢測用菌體培養基的實驗研究

徐 斐，農衛良，管 驍，秦旭銳，石服鑫

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093)

利用微量熱法對醬牛肉中的細菌進行快速定量檢測，需要對檢測用菌體培養基進行優化從而實現其快速增殖，以期縮短檢測時間，同時放大細菌生長熱信號。本文采用Plackett-Burman實驗設計確定了培養基配方的主要因素后，再用最陡爬坡實驗及Box-Behnken實驗設計進一步確定了各因素的最優水平。實驗結果表明，葡萄糖、pH、胰蛋白胨三個因素是影響醬牛肉中優勢細菌生長的主要因素;優化后的最佳培養基配方為:葡萄糖1.42g/L、胰蛋白胨8.45g/L、硫酸鎂0.2g/L、氯化鈉5g/L、酵母浸膏4.5g/L、pH 7.12。用此培養基培養醬牛肉中的細菌，可實現其快速增殖，并顯著縮短生長延滯期。

微量熱法，響應面分析，培養基優化，延滯期

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

受試菌種 均分離于市售醬牛肉中，由本實驗室鑒定、計數。

UV-2800型可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;超凈工作臺、全自動滅菌鍋、搖床等上海博訊有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 將活化好的各菌種按實際樣品中的平均比例混勻后，取5mL菌懸液接種于裝有150mL培養基的250mL三角瓶中，置于搖床(100r/min)中37℃培養。

1.2.2 培養基配方優化實驗設計

1.2.2.1 顯著影響因子的確定 根據菌種的大致營養需求，以7種對菌體生長可能造成較大影響的培養基成分以及pH作為實驗設計中的8個影響因素，以培養5h后的細菌生物密度(即發酵液在650nm處的吸光度，反映菌體生長情況)為響應值進行Plackett-Burman實驗設計，實驗次數共32次，因子選擇及實驗設計見表1。

表1 Plackett-Burman設計實驗中各因素的水平

1.2.2.2 最陡爬坡實驗 由于響應面擬合方程只在考察的緊接領域里才充分近似真實情形，在其他區域擬合方程與被近似的函數方程毫無意義。所以，要先逼近各因素最佳值區域后才能建立有效的響應面擬合方程?？梢酝ㄟ^做單因素實驗或由菌種的特性和發酵工藝來確定因素水平的范圍。最陡爬坡法以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速地逼近最佳值區域［6］。

1.2.2.3 響應面分析實驗 根據最陡爬坡實驗確定出的最佳值區域，采用旋轉中心點正交實驗法，配制不同的培養基。然后將細菌接種后37℃培養5h，測量其生物密度值，并進行數據分析。

本實驗設計、數據分析和模型建立均由SAS9.0輔助完成。

1.2.3 培養對比實驗 將按比例混合好的菌懸液分別接種到普通營養肉湯培養基與優化培養基中進行水浴搖床培養(37℃，搖床轉速100r/min)不同時間(分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5h)后，分別測定兩種培養液OD650值進行比較。

2 結果與分析

2.1 篩選顯著影響因子

本部分實驗采用八因子兩水平實驗設計。選擇7種培養基成分作為優化對象改變濃度，其它因素保持一致。測量培養液在5h后的650nm處吸光度，結果如表2所示。

表2 Plackett-Burman設計及實驗結果

表3 各因素的主要效應分析表

由表3可以看出，8個因素中對響應值影響顯著性依次為胰蛋白胨＞pH＞葡萄糖＞氯化鈉＞硫酸鎂＞酵母浸膏＞牛肉浸膏＞磷酸氫二鉀。其中胰蛋白胨、pH以及葡萄糖對細菌生長的影響最為顯著，其Pr＞F均小于0.05。因此響應面分析過程中確定胰蛋白胨、pH和葡萄糖三個因素為主要影響因素。其中，胰蛋白胨的濃度和pH對OD值的影響是負效應，葡萄糖的濃度對OD值的影響是正效應。且由于磷酸氫二鉀及牛肉浸膏對細菌生長的影響極小，因此在后面所配的培養基中不再添加。而硫酸鎂、氯化鈉、酵母浸膏則選擇較優水平，分別添加0.2、5、4.5g/L。

2.2 主要因素水平的確定(最陡爬坡實驗)

由Plackett-Burman實驗結果可知，在優勢菌液體培養過程中，葡萄糖、胰蛋白胨、pH這3個因素對細菌生長有重要的影響，根據這3個因素效應大小的比例設定它們的變化方向及步長進行實驗，設計及結果如表4所示。

表4 最陡爬坡實驗設計及結果

對各因素進行顯著性分析后結果如表3所示。

由表4可以看出，隨著實驗號的增加響應值先升高后降低。其中2號的響應值最大，而1號的響應值為0.748，大于3號實驗的0.699。由此可以推斷出最佳培養基應介于1號和2號之間。

2.3 響應面分析法優化培養基結果

根據Plackett-Burman實驗以及最陡爬坡實驗的實驗結果確定的實驗因素及水平確定3個因素的水平值，其實際值如表5所示。

表5 響應面分析實驗因素水平表

根據旋轉中心點正交實驗設計原理，進行3因素3水平的響應面分析實驗設計23個實驗點，其中8個實驗點為析因點，零點重復9次［9-10］。具體設計如表6所示。

表6 響應面分析實驗設計與結果

以細菌接種培養5h后在650nm處的吸光度為響應值，采用SAS9.0軟件對表6的實驗結果進行方程擬合回歸分析，結果如方程式(1)和表7、表8所示。

表7 回歸方程系數顯著性檢驗

表8 響應面分析實驗方差分析表

由表7的結果可知，方程式(1)的R2值為0.81，可見方程對實驗結果的擬合關系良好［11-12］。同時，由表8可看出，方程的一次項、二次項的影響十分顯著，交叉項作用反而不是很明顯。根據上述回歸方程作出響應面立體分析圖(見圖1～圖3)，可更直觀地反映出各因素對響應值的影響情況。

圖1 葡萄糖與胰蛋白胨對菌體生長的影響

圖2 胰蛋白胨與pH對菌體生長的影響

圖3 葡萄糖與pH對菌體生長的影響

圖1～圖3直觀地反映了各因素對響應值的影響，葡萄糖、胰蛋白胨、pH對響應值的影響都極為顯著，曲面較陡。從圖1可以看出，當葡萄糖質量濃度不變時，隨著胰蛋白胨的質量濃度增大，響應值先是逐漸增大，達到最大值之后，逐漸減小;胰蛋白胨質量濃度不變時，隨著葡萄糖質量濃度的增大，響應值的變化也是先增大后減小。同樣從圖2、圖3可見，隨著pH、葡萄糖和胰蛋白胨質量濃度的變化，響應值的變化趨勢也是先增后減，呈典型的二次函數變化趨勢。

對方程式(1)進行偏導求零，得出該模型響應值存在極值點，對應各因素的取值分別為:X1為0.42164、X2為0.55212、X3為-0.57218，對應的實際值分別為:葡萄糖1.42g/L;胰蛋白胨8.45g/L;pH7.12時，響應值Y即生物密度最大達0.943，微生物生長最好。

2.4 驗證實驗

根據以上的培養基優化條件進行驗證實驗，共進行5次搖床培養實驗，測得響應值分別為0.940、0.952、0.938、0.959、0.949，平均值為0.947，與回歸方程所得的估測值(0.943)差異不顯著，說明采用RSA法優化得到的實驗參數真實可靠，具有實用價值。

2.5 與普通營養肉湯的對比實驗

圖4列出了混合優勢菌在優化培養基及普通營養肉湯培養基中的生長情況。從圖中可以看出，混菌在優化培養基中的生長速度要遠大于普通培養基。培養270min后，普通培養基的OD650為0.561，而優化培養基的OD650值達1.061，是普通營養肉湯培養基的1.9倍。而且優化培養基OD值曲線的斜率也明顯大于普通培養基。由此表明，細菌在優化培養基中的生長延滯期更短，且生長速度更快、代時短，更有利于短時間內混合菌的大量繁殖，有利于后續的細菌微量熱實驗。

圖4 菌種在兩種培養基中的生長狀況

3 結論

本文對醬牛肉中的污染菌進行了培養基優化研究，以促進其快速增殖，從而達到放大細菌生長熱效應以及縮短放熱時間的目的，以利于微量熱法對其進行定量研究。通過Plackett-Burman實驗設計確定了葡萄糖、pH、胰蛋白胨三因素是影響醬牛肉中優勢菌生長的主要因素;經最陡爬坡實驗及中心組合實驗結合響應面分析法優化出培養基配方為:葡萄糖含量為1.42g/L、胰蛋白胨含量為8.45g/L、pH為7.12、硫酸鎂含量為0.2g/L、氯化鈉含量為5g/L、酵母浸膏含量為4.5g/L。用此優化培養基培養醬牛肉中的細菌，可促進其快速生長，并縮短其生長延滯期，有利于下一步的細菌微量熱的定量實驗研究。

［1］章海鵬，管驍，徐斐，等.利用量熱法快速檢測食品中細菌總數的方法研究［J］.食品工業，2009(1):70-73.

［2］王晶，王林，黃曉蓉.食品安全快速檢測技術［M］.北京:化學工業出版社，2002.

［3］Higuera-Guisset J，Rodríguez-Viejo J，Chacón M，et al. Calorimetry ofmicrobialgrowth using a thermopile based microreactor［J］.Thermochimica Acta，2005，427:187-191.

［4］Marison I，Liu J-S，Ampuero S，et al.Biological reaction calorimetry:development of high sensitivity bio-calorimeters［J］. Thermochim Acta，1998，309:17-173.

［5］儲炬.現代工業發酵調控學［M］.北京:化學工業出版社，2002，251.

［6］Cochran W G，Cox G M.Some methods for the study of response surfaces.In Experimental designs［M］.New York: Wiley，1992:335-375.

［7］郝學財，余曉斌，劉志鈺，等.響應面方法在優化微生物培養基中的應用［J］.食品研究與開發，2006，27(1):38-41.

［8］江漢湖.食品微生物學［M］.北京:中國農業出版社，2005.

［9］張健，高年發.利用響應面法優化丙酮酸發酵培養基［J］.食品與發酵工業，2006，32(8):52-55.

［10］XiaoGuan，Huiyuan Yao.Optimization ofViscozyme L-assisted extraction of oat bran protein using response surface methodology［J］.Food Chemistry，2008，106:345-351.

［11］Haber A，Runyon R.General statistics(3rd ed)［M］. Henika:Addison-Wesley，Reading，MA，1977.

［12］Kong Q，He G Q，Chen Q H，et al.Optimization of Medium Composition for Cultivating Clostridium butyricum with Response Surface Methodology［J］.Journal of Food Science，2004，69(7): 163-168.

Optimization of culture medium for rapid detection of bacterial in food using microcalorimetric method by response surface analysis

XU Fei，NONG Wei-liang，GUAN Xiao，QIN Xu-rui，SHI Fu-xin
(School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China)

During the rapid detection of bacterial in beef using the microcalorimetry method，the optimization of cultural medium is important because it is useful for the reduction of detection time and the enlargement of bacterial growth heat.In this paper，the Plackett-Burman design was used to evaluate the most important factors which affected the bacterial growth firstly.Furthermore，the steepest ascent and Box-Behnken design were used to approach the optimal level of the medium composition.The results showed that the concentration of glucose，tryptone and pH played most important roles in influencing the growth of the dominant bacteria in beef.The optimal cultural medium was determined as follows:glucose 1.42g/L，tryptone 8.45g/L，MgSO40.2g/L，NaCl 5g/L，yeast extract 4.5g/L，pH 7.12.It was possible that the bacterial in beef grew rapidly under the condition of the optimal cultural medium，and the lag phase of the bacterial was shortened greatly.

microcalorimetry;response surface analysis;optimization of cultural medium;lag phase

TS201.1

A

1002-0306(2011)03-0188-05

在影響我國食品安全的諸因素中，微生物污染問題高居首位，開發快捷準確的微生物檢測方法尤有必要。國內外近年來開發了一些微生物快速定量檢測技術［1-2］，包括:酶聯免疫吸附分析技術(ELISA)、DNA探針技術、聚合酶鏈式反應(PCR)技術、ATP生物發光技術、直接表面熒光濾膜計數技術(DEFT)、比濁法、阻抗法等。然而這些方法或多或少都存在自身不可克服的局限性，如儀器復雜昂貴、檢測成本高、特異性過強、前處理復雜，造成應用范圍有較大局限性。隨著微量熱技術的發展，利用該技術進行微生物的定量研究已成為可能［3-4］。微量熱法主要優勢在于檢測速度快、操作簡單、適用范圍廣，其原理為利用微生物生長產生的熱效應。實際上微生物生長熱過程緩慢且熱效應小，實現其準確測定對設備要求很高。因此，若能縮短微生物生長放熱過程，且放大熱信號，則可對速測產生重要意義。微生物自身具有一定的營養需求和生長特性，完全可通過改變其生長環境的辦法來改善生長狀況，因此可對量熱用培養基進行優化，使微生物能在較短時間內放出更多的熱，以便于快速檢測［2］。微生物的生長代謝受制于培養基的組分如碳源、氮源、生長因子、無機鹽等多種因子的影響。培養基的成分對微生物發酵液含菌量有很大的影響［5］。在多因子起作用的生化過程中，如何快速找出主要因子并進行優化并不是一件易事。響應面方法(Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的實驗設計得到實驗數據，并采用回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法［6-7］。本研究根據微生物的營養需要特性［8］，采用響應面分析法對醬牛肉中優勢菌的量熱培養基進行優化研究，以期獲得顯著縮短細菌生長延滯期的培養基配方，為量熱法快速檢測微生物研究提供新的思路和方法。

2010-01-12

徐斐(1972-)，女，博士，教授，主要從事食品安全快速檢測方面的研究。

上海市教委科研創新項目(08ZZ77);上海市研究生創新基金項目(JWCXSL0902);上海高校選撥培養優秀青年教師科研專項基金(slg-07047)。