Acidothermus cellulolyticus11B葡萄糖異構酶基因的克隆、表達及酶活性研究

王曉樂，薛慶海，江 波，沐萬孟

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

Acidothermus cellulolyticus11B葡萄糖異構酶基因的克隆、表達及酶活性研究

王曉樂，薛慶海，江 波，沐萬孟*

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

葡萄糖異構酶是生物法轉化葡萄糖為果糖制備果葡糖漿的關鍵酶。本文克隆到一種葡萄糖異構酶基因xyl，來源于嗜酸耐熱型微生物Acidothermus cellulolyticus 11B(ATCC 43068)。以pET-22b(+)為載體質粒，E.coli BL21 (DE3)為宿主細胞，構建了基因重組菌，IPTG可誘導目的重組葡萄糖異構酶過量表達;經親和層析純化的重組蛋白樣品進行SDS-PAGE分析，在約43kDa處出現顯著的特征蛋白條帶;活性檢測結果表明該重組葡萄糖異構酶具有較高的果糖轉化活性。

葡萄糖異構酶，果葡糖漿，克隆，表達，親和層析

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Acidothermus cellulolyticus 11B(ATCC 43068)購自美國標準菌種收藏所;表達載體pET-22b(+)中國科學技術大學生命科學學院王玉珍教授惠贈;DNA polymerase、膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3) 購自上海生工公司;T4 DNA連接酶、Wide Range DNA Marker(500 -10，000)、DNA marker(λ/EcoR I+Hind III)、限制性內切酶Nde I、Xho I及PCR產物純化試劑盒、克隆載體PMD 19-T simple vector 購自寶生物工程(大連)有限公司;Chelating Sepharaose Fast Flow 購自安馬西亞公司;其它試劑 均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 Acidothermus cellulolyticus 11B xyl基因的PCR擴增 根據Acidothermus cellulolyticus 11B xyl基因序列設計引物，為方便其定向克隆，于上下游引物5’端分別引入Nde I和Xho I酶切位點。引物序列如下:

以Acidothermus cellulolyticus 11B菌液DNA為模板，PCR擴增xyl基因。PCR循環條件為:94℃預變性5min;94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，進行35個循環;最后72℃延伸10min。

1.2.2 PCR產物的克隆、鑒定 將純化的PCR產物以T4 DNA連接酶連接至PMD19-T simple Vector，連接產物轉化至E.coli DH5α感受態細胞中，涂布藍白斑篩選平板，37℃培養過夜，白色菌落初步確定為陽性菌落。挑取白色單菌落至 LB液體培養基(含50μg/mL氨芐抗生素)中，37℃培養過夜，通過菌液PCR擴增、抽提質粒確定重組質粒大小及酶切分析，得到陽性克隆，送上海生工測序。將鑒定為陽性克隆的重組質粒命名為T-Ac-xyl。

1.2.3 Acidothermus cellulolyticus 11B GI基因重組菌的構建 將1.2.2中的陽性重組質粒T-Ac-xyl及質粒pET-22b(+)分別用Nde I和Xho I雙酶切，回收目的片段后，以T4 DNA連接酶進行連接，連接產物轉化至E.coli BL21(DE3)感受態細胞中。通過篩選與鑒定，獲得重組質粒陽性克隆，重組質粒命名為pET22b-Ac-xyl，重組菌命名為E.coli BL21(pET22b -Ac-xyl)。

1.2.4 Acidothermus cellulolyticus 11B GI基因重組菌的誘導表達 將重組菌E.coli BL21(pET22b-Acxyl)接種于4mL LB液體培養基(含50μg/mL氨芐抗生素)中，37℃條件下200r/min培養過夜;將其接種至200mL LB培養基中，37℃，200r/min培養至OD值為0.6～0.8［7］，加入終濃度為 1mmol/L的 IPTG，28℃條件下200r/min誘導培養6h。

1.2.5 重組GI的純化 離心收集菌體，以Binding Buffer(50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH 7.5)重懸菌體，超聲波破碎細胞(250W，超聲1s，停頓2s，全程工作時間 6min)后，離心(15000r/min，20min，4℃)棄細胞碎片，收集上清液進行親和層析純化。采用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和介質填充層析柱，對重組蛋白進行純化。上柱前預先以3倍柱體積的Binding Buffer平衡親和柱，樣品上柱后以Wash buffer(50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，pH7.5)洗脫雜蛋白，再用Elution buffer(50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，pH7.5)洗脫重組蛋白，最終用Sample buffer(50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，pH 7.5)對洗脫蛋白進行透析(以上操作均在4℃條件下進行)。將純化的重組蛋白進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組GI生物活性測定 GI可催化葡萄糖異構化生成果糖，底物葡萄糖與產物果糖含量可通過HPLC進行測定。HPLC條件:Waters 600高效液相色譜儀，Sugarpak-1鈣型陽離子交換柱，Waters 2410示差折光檢測器;流動相:純水;柱溫:85℃;流速: 0.4mL/min;進樣量:10μL。

2 結果與討論

2.1 Acidothermus cellulolyticus 11B xyl基因的PCR擴增、克隆及鑒定

以Acidothermus cellulolyticus 11B菌液DNA為模板，擴增出了一條約1.2kb的條帶(見圖1)，與預期的擴增產物大小吻合。

圖1 xyl基因的PCR擴增片段檢測

使用T4 DNA連接酶將純化后的 Acidothermus cellulolyticus 11B xyl基因連接到PMD 19-T載體，轉化培養，經菌液PCR鑒定、提質粒檢測質粒大小(圖1)，得到陽性重組質粒T-Ac-xyl，送上海生工測序，測序結果顯示所得基因與NCBI中已知基因完全吻合。

2.2 重組表達質粒pET22b-Ac-xyl的構建

將重組質粒T-Ac-xyl與表達載體pET-22b (+)分別使用Nde I和Xho I雙酶切，用T4 DNA連接酶進行連接，獲得重組表達質粒pET22b-Ac-xyl。重組質粒pET22b-Ac-xyl經Nde I和Xho I雙酶切，得到pET-22b(+)線性片段和插入的目的基因片段，該片段與PCR產物大小相同，pET22b-Ac-xyl酶譜鑒定結果見圖2。

2.3 基因重組菌的誘導表達及重組GI的純化

對重組菌E.coli BL21(pET22b-Ac-xyl)的誘導表達進行了初步研究，為了防止目的蛋白GI形成大量包涵體，使用誘導溫度28℃。在此溫度下，1mmol/L的IPTG誘導6h可使重組GI的量達到重組菌表達總蛋白的40%以上(圖3)。經鎳柱親和層析的重組GI樣品進行SDS-PAGE分析(圖4)，該重組GI的分子量約為43kDa，與預期分子量相吻合。

圖2 重組表達質粒pET22b-Ac-xyl的酶切鑒定注:其中泳道1為DNA標樣;泳道2為pET22b-Ac-xyl質粒經NdeI和XhoI雙切產物。

圖3 重組GI的在E.coli BL21(DE3)中的表達注:其中泳道1為蛋白質標樣;泳道2為重組菌經誘導表達后的全細胞蛋白。

圖4 SDS-PAGE分析親和層析純化的重組GI注:其中泳道1為蛋白質標樣;泳道2為鎳柱親和層析純化后的重組GI。

2.4 重組GI的活性研究

利用重組GI細胞進行果糖轉化實驗(如圖5)，反應條件為80℃，pH 6.5，在500μg/mL的葡萄糖反應體系中，80℃條件下反應 4h果糖含量達到344.9μg/mL，轉化率為69.98%。而相同條件下，以非重組菌E.coli BL21(DE3)細胞作為果糖生物轉化合成實驗的對照，其最高果糖含量為99μg/mL，充分說明GI基因在E.coli中得到了正確的表達，并具有較高生物活性。

3 結論

葡萄糖異構酶是工業上大規模生產高果糖漿的關鍵酶之一，提高其反應的溫度可以提高果糖的轉化率，具有很高的工業價值。利用基因克隆技術，將耐熱葡萄糖異構酶基因克隆至表達載體，通過提高表達水平可以得到有可觀潛在用途的熱穩定性葡萄糖異構酶。

圖5 重組GI細胞催化葡萄糖生產果糖的進程曲線

本文以耐熱菌Acidothermus cellulolyticus 11B葡萄糖異構酶基因為模板，通過PCR及基因克隆技術，將目的基因構建到pET-22b(+)為載體中，獲得重組質粒pET22b-Ac-xyl，并將該質粒轉化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中獲得基因重組菌。IPTG可誘導該基因重組菌過量表達重組GI，表達量達到細胞總蛋白的40%以上。經親和層析純化的重組蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳分析，約在43kDa處出現特征蛋白條帶，進一步證明了Acidothermus cellulolyticus 11B xyl基因在 E.coli BL21中得到了正確的表達。對該重組GI的活性進行了初步研究，在80℃下反應4h果糖轉化率為69.98%，表明在大腸桿菌 E.coli BL21中成功地表達了具有生物活性的重組GI，且該GI具備提高工業生產果糖產率的潛能。

［1］Jensen VJ，Rugh S.Industrial scale application of immobilized glucose isomerase［J］.Methods Enzymol，1987，136:356-370.

［2］Antrim RL，Colilla W，Schnyder BJ.Glucose isomerase production of high fructose syrups［J］.Appl Biochem Bioeng，1979，2:97-155.

［3］Drocourt D，Bejar S，Calmels T，et al.Nucleotide sequence of the xylose isomerase gene from Streptomyces violaceoniger［J］. Nucleic Acids Res，1988，16:9337.

［4］Park BC，Koh S，Chang C，et al.Cloning and expression of the gene forxylose isomerase from Thermus flavus AT62 in Escherichia coli［J］.Appl Biochem Biotechnol，1997，62:15-27.［5］Bandish RK，Hess JM，Epting KL，et al.Glucose-fructose conversion at high temperatures with xylose(glucose)isomerases from Streptomyces murinus and two Thermotoga species［J］. Biotechnol Bioeng，2002，80:185-194.

［6］Bhosale SH，Rao MB，Deshpande VV.Molecular and industrial aspects of glucose isomerase［J］.Mcirobiol Rev，1996，60: 280-300.

［7］Brown SH，Sjoholm C，Kelly RM.Purification and characterization ofa highly thermostable glucose isomerase produced by the extremely thermophilic eubacterium Thermotoga maritime［J］.Biotechnol Bioeng，1993，41:878-886.

［8］Cha J，Batt CA.Lowering the pH optimum of D-xylose isomerase:the effect of mutations of the negatively charged residues［J］.Mol Cells，1998，8:374-382.

［9］Barabote RD，Xie G，Leu DH，et al.Complete genome of the cellulolytic thermophile Acidothermus cellulolyticus 11B provides insights into its ecophysiological and evolutionary adaptations［J］. Genome Res，2009，19:1033-1043.

Cloning，expression and characterization of Acidothermus cellulolyticus 11B glucose isomerase

WANG Xiao-le，XUE Qing-hai，JIANG Bo，MU Wan-meng*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Glucose isomerase is the main enzyme for biotransformation of high-fructose corn syrup.A gene，

encoding glucose isomerase from Acidothermus cellulolyticus 11B(ATCC 43068)was cloned and over expressed in Escherichia coli.The recombinant glucose isomerase was purified to electrophoretic homogeneity by affinity chromatography.The recombinant enzyme molecular weight was about 43kDa with high bioconversion activity.

glucose isomerase;high-fructose corn syrup;cloning;expression;affinity chromatography

Q789

A

1002-0306(2011)03-0192-03

葡萄糖異構酶(Glucose isomerase，GI，EC 5.3.1.5)，又稱木糖異構酶(xylose isomerase，XI)［1］，可以催化D-葡萄糖等醛糖至D-果糖等相應酮糖的異構化反應，在規?；苽涔咸菨{和結晶果糖等食品工業中具有重要的作用［2］。目前，已經有很多種微生物來源的GI被發掘和鑒定，其表達基因被序列測定、克隆及異源表達［3-4］。熱穩定性及反應pH是GI工業應用重要的兩個參數。一方面，反應溫度越高，反應速率就越快，較高溫條件下(60℃以上)更有利于果糖的生成，可以降低果糖轉化生產成本和提高產物產量［5］;另一方面，工業生產要求GI最適反應pH為弱酸性，因為在偏酸性條件可以減少非特異性副反應、可以減少褐變反應，提高產品質量［6］。通過篩選嗜酸、耐熱性微生物來源的GI［7］，及利用蛋白質工程技術改造GI［8］獲得適合工業化應用的突變酶，是目前 GI研究的熱點和趨勢。Acidothermus cellulolyticus 11B(解纖維熱酸菌)是從酸性溫泉中篩選獲得的微生物，其基因組序列于2008年被完整測序［9］。Acidothermus cellulolyticus 11B同時兼具了耐熱與耐酸的特性，屬于產GI微生物篩選與工業應用的研究趨勢。本文以嗜酸耐熱菌 Acidothermus cellulolyticus 11B基因組為模板，通過PCR擴增獲得GI的編碼基因xyl，以pET22b(+)為載體，構建獲得重組質粒pET22b-ac-xyl，并在大腸桿菌中實現成功表達，表達產物GI被鑒定具有較高的生物活性，對于弱酸穩定與熱穩定性的GI開發與工業應用具有一定的創新性與指導意義。

2010-04-12 *通訊聯系人

王曉樂，本科生，研究方向:食品科學與工程。

“十一五”國家863資助項目(2006AA10Z334)資助。