發酵低溫豆粕生產堿性蛋白酶的工藝研究

吳海波，江連洲，趙 英，刑常瑞

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030; 2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

發酵低溫豆粕生產堿性蛋白酶的工藝研究

吳海波1，2，江連洲1，*，趙 英2，刑常瑞1

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030; 2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

以提油后的副產物——低溫豆粕為培養基的主要成分，利用枯草芽孢桿菌為發酵劑發酵產酶，以堿性蛋白酶活力為考察指標，通過響應面法對培養基和發酵條件進行了優化。結果顯示在發酵條件一定的前提下，當培養基組成為1.48%葡萄糖、0.57%豆粕、0.05%KH2PO4時，堿性蛋白酶有最高酶活1792±47.72294u/mL;以此為培養基，對發酵初始pH、溫度、接種量三個條件進行優化，發現當pH8.9，接種量為4.9%，35.4℃時堿性蛋白酶活最高。此條件下進行三次平行實驗，酶活為2401u/mL，比未優化前提高了37%，從而以低成本的原料，得到較高的經濟效益。

枯草芽孢桿菌，堿性蛋白酶，響應面方法

1 材料與方法

1.1 材料與設備

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 購自于中國工業微生物菌種保藏中心;牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、酪氨酸、福林酚試劑、三氯乙酸、無水碳酸鈉、氯化鈉 均為分析純;低溫脫脂豆粕 哈爾濱高科生物技術公司;斜面保藏培養基蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂1.5%，pH7.5，121℃滅菌20min;種子培養基 蛋白胨1%、牛肉膏 1%、氯化鈉 0.5%，自然 pH，121℃滅菌20min。

DK-2000-ⅢL型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有新公司;PHS-3C型酸度計 上海盛磁儀器有限公司;TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;HZQ-XIOO型振蕩培養箱 中國哈爾濱東聯電子技術開發有限公司;LDZX-50FB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;無菌操作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;Z36HK型高速恒溫離心機 德國HERMLE Labortechnik GmbH公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗流程

1.2.2 菌種活化 取1～2環斜面保存菌種接入裝有50mL種子培養基的250mL三角瓶中，37℃下160r/min振蕩培養20～24h，使菌體濃度達到108cfu/mL。

1.2.3 原料預處理 將低溫脫脂豆粕粉碎成豆粉，過100目篩。

1.2.4 堿性蛋白酶活力的測定 發酵液在4℃條件下，5000r/min離心20min取上清液，采用Folin酚法測定堿性蛋白酶活力［3］。酶活定義為:40℃條件下，1min水解酪素產生1μg酪氨酸定義為1個酶活力單位，以u/mL表示。

1.2.5 發酵培養基成分的確定

1.2.5.1 碳源的確定 不同碳源對枯草芽孢桿菌發酵產酶的影響:碳源分別為蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖，添加量為1%;2%豆粕，接種量為5%、pH9，按料液體積∶瓶體積為1∶5比例裝料，在37℃條件下，160r/min振蕩培養36h。

1.2.5.2 發酵時間的確定 接種的上述發酵培養基在37℃下160r/min振蕩培養60h，每隔6h測一次酶活。

1.2.6 發酵培養基的優化

1.2.6.1 發酵培養基各成分濃度的確定 不同豆粕濃度對枯草芽孢桿菌發酵產粗酶的影響:豆粕濃度分別為0、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%，在37℃的條件下，葡萄糖濃度為1%，KH2PO4的濃度為0.075%，接種量為5%、pH9，發酵42h。

不同碳源濃度對枯草芽孢桿菌發酵產粗酶的影響:當葡萄糖濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%時，37℃的條件下，豆粕濃度為0.75%，KH2PO4的濃度為0.075%，接種量為5%、pH9，發酵42h。

不同無機鹽濃度對枯草芽孢桿菌發酵產粗酶的影響:當 KH2PO4濃度分別為 0、0.025%、0.05%、0.075%、0.1%、0.125%時，在37℃的條件下，豆粕濃度為0.75%，葡萄糖濃度為1%，接種量為5%、pH9，發酵42h。

1.2.6.2 響應面實驗 在單因素實驗的基礎上，選取葡萄糖含量x1、豆粕濃度x2、KH2PO4濃度x3為自變量，以堿性蛋白酶活Y為響應值，根據中心組合設計原理設計響應面分析實驗，表1為因素水平編碼表。

表1 因素水平編碼表

1.2.7 發酵條件的優化

1.2.7.1 發酵條件的單因素實驗 當培養基初始pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0時，在37℃條件下，接種量為5%、發酵42h。

發酵溫度分別為25、31、37、41、43℃時，接種量為5%、pH9，發酵42h。

接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%時，37℃，培養基起始pH9的條件下，發酵42h。

1.2.7.2 響應面實驗 在單因素實驗的基礎上，應用響應面優化法進行過程優化。以pH、發酵溫度、接種量為自變量，以堿性蛋白酶活值為響應值Y，表2為因素水平編碼表。

表2 因素水平編碼表

2 結果與分析

2.1 酶活力標準曲線的制作

所得標準曲線如圖1所示，回歸方程為 y= 0.1184x+0.02246，R2=0.9993。

圖1 酶活力測定標準曲線

根據標準曲線得酪氨酸標準曲線的回歸方程為:

y=0.01184x+0.02246

按式(1)計算蛋白酶酶活:

蛋白酶活力X=K×A×4/10×N×1/V 式(1)

式中:A-平行實驗的平均吸光度;K-吸光常數; 4-離心管中反應液總體積(mL);10-反應時間10min;N-稀釋倍數;V-取酶液體積(mL)。

2.2 發酵培養基成分的確定

豆粕是大豆提油后的副產物，蛋白質含量豐富，在43%～48%左右，并且還含有少量的糖、無機鹽、維生素和某些生長因子，因而菌種可在以豆粕為氮源的培養基中生長良好［4］。本實驗以低溫脫脂豆粕為發酵培養基的唯一氮源，一方面是豆粕可以提供微生物生長所需的氮源;另一方面豆粕中的大豆蛋白可被產生的酶類水解成大豆多肽，提高蛋白質生物效價，有利于吸收利用。

2.2.1 碳源的選擇 碳源是供給菌種生命活動所需能量的重要來源，不同的碳源影響著產物的生產能力?？莶菅挎邨U菌發酵選擇的碳源為蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖。

由圖2可知，以葡萄糖作為碳源時，產酶量最高，這是由于葡萄糖在所有碳源中最易被利用，因此微生物能迅速利用碳源進行生長代謝及酶的合成。

圖2 不同碳源對發酵產酶的影響

2.2.2 發酵時間對酶活的影響 圖3顯示隨著發酵時間的延長，枯草芽孢桿菌產生的蛋白酶活力先增加后降低。在0～12h之前幾乎不產酶活，發酵24h后酶活急劇升高，42h時，酶活力達到高峰，其后酶活下降。因此發酵時間選擇42h。

圖3 發酵時間對發酵酶活的影響

2.2.3 培養基中各成分濃度的確定

2.2.3.1 培養基中各組分不同濃度時的蛋白酶活見圖4～圖6。從圖4中可看出，在葡萄糖濃度為1%～2%之間，發酵酶活最大，而濃度在小1%和大于2%范圍內，產酶量減少。由于葡萄糖是一種速效碳源，菌體由種子液接種到發酵液中時，迅速獲得大量碳源維持繼續生長勢頭，從而大量產酶;但過高的葡萄糖濃度(＞2%)反而會降低酶產量，因為過多的葡萄糖會加速菌體呼吸，使培養基中溶解氧迅速消耗，不能滿足菌體生長的需要［5］。因此，葡萄糖優化范圍選定為1%～2%范圍內。

豆粕濃度對蛋白酶產量具有舉足輕重的作用。為獲得最高的酶產量，豆粕濃度也必須保證在一個合適的范圍內。氮源過多，菌體生長過于旺盛，導致pH偏高和溶氧不足，不利于酶的積累;氮源不足，影響菌體生長繁殖，易引起菌體衰老自溶，從而影響酶產量。從圖5可知，豆粕濃度優化范圍選定在0.1%～1%之間。

圖4 葡萄糖濃度對發酵產酶的影響

圖5 不同豆粕濃度對發酵產酶影響

從圖6可知，KH2PO4的濃度對產酶量有著重要的影響。在KH2PO4濃度0～0.09%范圍內，有最大酶活，所以優化范圍選定為此區間。

圖6 不同濃度的KH2PO4對發酵產酶影響

2.2.3.2 響應面實驗安排及實驗結果 本實驗應用響應面優化法進行過程優化。響應面實驗方案及結果見表3。實驗號1～14為析因實驗，15～20為6個中心實驗，用以估計實驗誤差。

2.2.3.3 響應面實驗結果分析 通過統計分析軟件SAS9.1進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如下:

從表4中可看到，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著(p＜0.001)，失擬項不顯著(p＞0.05)，并且該模型R2=93.77%88.16%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。由F檢驗，可知因子貢獻率為:x2＞x1＞x3，即低溫脫脂豆粕濃度＞葡萄糖濃度＞KH2PO4濃度，即低溫脫脂豆粕濃度對酶活影響最顯著，其次是葡萄糖濃度，KH2PO4濃度對酶活影響最不顯著;三者之間的相互影響對酶活的影響表現為:葡萄糖濃度和低溫脫脂豆粕濃度交互影響對堿性蛋白酶活影響顯著(p＜0.05)，見圖7;而葡萄糖濃度和KH2PO4濃度，低溫脫脂豆粕濃度和KH2PO4濃度交互影響對酶活影響不顯著(p＞0.05)。

表3 響應面實驗方案及實驗結果

表4 回歸與方差分析結果

圖7 Y=f(x1，x2)的響應面

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優響應結果。由表5可知，當低溫脫脂豆粕濃度為0.57%，葡萄糖濃度為1.48%，KH2PO4濃度0.05%時，響應面(酶活)有最優值1792±47.72294u/mL。

表5 響應面尋優結果

2.3 發酵條件的優化

在各個外部培養條件中，初始pH和發酵溫度直接影響菌體的生長和蛋白酶類的產量，只有在合適的范圍內，菌體才能生長良好同時產生蛋白酶。同樣，接種量的多少也影響著酶的產量;接種量太大，短時間營養物質迅速消耗掉，抑制了菌種的生長和繁殖，不利于產酶;接種量太少，菌種增殖緩慢，產酶量減少［6-7］。因此，我們以堿性蛋白酶活為響應值，對初始pH和發酵溫度、接種量進行優化。

不同pH、不同發酵溫度、不同接種量條件下的產酶情況見圖8～圖10。

從圖8中可看到，在初始pH為9時有最大酶活，因此優化范圍選擇pH8～10;溫度對微生物的生長產生重要影響，溫度過低，菌種生產遲緩，不易產酶;溫度過高，其生長周期變短，菌株過早老化，也不利于產酶［8］。從圖9可知，隨著發酵溫度的升高，枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力增強，35℃以后蛋白酶開始減少，因此，發酵溫度范圍選擇在31～40℃之間。

圖8 不同起始pH對發酵產酶的影響

圖9 不同發酵溫度對發酵產酶影響

接種量對菌體產酶有較大影響，接種量太少，菌群較難繁殖;接種量太高又抑制了枯草芽孢桿菌的生長和繁殖，更不利于其產蛋白酶，因此選擇合適的接種量尤為重要［9］。從圖10可知，在接種量2%時酶活最低，接種量為6%時酶活最高。因此，接種量的優化范圍選擇為4%～8%。

圖10 不同接種量對發酵產酶的影響

2.3.1 響應面實驗安排及結果 響應面實驗方案及結果見表6。實驗號1～14為析因實驗，15～20為6個中心實驗，用以估計實驗誤差。

表6 響應面實驗方案及實驗結果

2.3.2 響應面實驗結果分析 通過統計分析軟件SAS9.1進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如下:

由表7可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著(p＜0.001)，失擬項不顯著(p＞0.05)，并且該模型 R2=90.47%81.89%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。由F檢驗，可以得到因子貢獻率為:x2＞x3＞x1，即對酶活影響的作用分別為:溫度＞接種量＞pH;三者間相互作用對酶活的影響為:溫度和pH交互影響對菌體產堿性蛋白酶量影響顯著(p＜0.05)，見圖11，而pH和接種量，溫度和接種量交互影響對菌體產堿性蛋白酶量影響不顯著(p＞0.05)。

表7 回歸與方差分析結果

圖11 Y=f(x1，x2)的響應面

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優響應結果，由表 8可知，當溫度為35.4℃，接種量為4.9%，pH為8.9時，響應面(酶活)有最優值2407.9u/mL。

表8 響應面尋優結果

2.3.3 驗證實驗與對比實驗 在響應面分析法求得的最佳條件下，即溫度為35.4℃，接種量為4.9%，pH為8.9時進行平行實驗(3次)，酶活3次平行實驗的均值為2401u/mL，酶活預測值為2407.9u/mL。說明響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好，比未優化前(1745u/mL)提高了37%。

3 討論與結論

本實驗在以提油副產物——低溫豆粕為培養基主要成分，枯草芽孢桿菌為發酵菌株，以堿性蛋白酶活為考察指標，對培養基中的三個成分——豆粕、葡萄糖、KH2PO4的濃度進行優化，結果顯示最佳培養基組成為:1.48%葡萄糖、0.57%豆粕、0.05%KH2PO4。

以此為培養基，應用響應面法對發酵起始pH、接種量、發酵溫度三個發酵條件進行優化，結果顯示當溫度35.4℃，接種量為4.9%，pH8.9，發酵42h，酶活有最高值2401u/mL。

姚剛［10］利用枯草桿菌發酵產堿性蛋白酶，優化后的各培養條件為:酵母浸粉2%、蔗糖1.5%、0.5%吐溫80、硫酸鎂0.02%，4%接種量，起始pH9，37℃發酵36h，堿性蛋白酶活力達1670u/mL。本研究與姚剛所用菌種相同，通過采用不同的培養基組分，考慮到各種條件下的相互影響，在培養基成分盡可能簡單，易操作的前提下，大大提高了酶活，是其的146%，且成本低廉，更易實現工業化生產。

［1］Anwar A，Saleemuddin M.Alkaline Protease:A Review［J］. Bioresource Tech，1998，64:175-183.

［2］Ito S，Kobayashi T，Ara K，et al.Alkaline detergent enzymes from alkaliphiles:enzymatic properties，genetics，and structures［J］.Extremophiles，1998，2:185-190.

［3］IemuraY，YamadaT，Takahashi T，et al.Properties of the peptides liberated from rice protein in Sokujo-moto［J］.Biosci and Bioeng，1999，88(3):276-280.

［4］El-Sayed A FM.Alternative Dietary Protein Sources for Famed Ti-lap ia，Oreochromis Spp［J］.Aquaculture，1999，179 (5):13-23.

［5］余勃.枯草芽孢桿菌發酵豆粕生產大豆活性肽的研究［D］.博士學位論文，2006:57-58.

［6］EllaiahP，AdinarayanaK.Response surface optimization of the cultural conditions for the Production of alkaline Protease［J］.Sei Ind Res，2001，60:868-875.

［7］Beg QK，Saxena RK，Gupta R.Kinetic constants determination for an alkaline Protease from Bacillus mojavensis using response surface methodology［J］.Biotechnol Bioeng，2002，78:289-295.

［8］吳暉，卓林霞，解檢清，等.發酵條件對枯草芽孢桿菌發酵豆粕中的蛋白酶活力的影響［J］.現代食品科技，2008，24 (10):973-976.

［9］舒丹，李宏，嚴建華，等.高溫芽孢桿菌堿性蛋白酶發酵條件及酶性質研究［J］.四川大學學報，2004，41(4):856-860.

［10］姚剛，程建軍，孫鵬，等.枯草芽孢桿菌發酵產堿性蛋白酶的研究［J］.食品科學，2009，30(23):347-351.

Alkaline protease produced by Bacillus Subtilis with defatted soy flour

WU Hai-bo1，2，JIANG Lian-zhou1，*，ZHAO Ying2，XING Chang-rui1
(1.Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 2.The National Research Center of Soybean Engineering and Technology，Harbin 150030，China)

In this study，alkaline protease activity produced by Bacillus Subtilis as an index，culture and fermenting condition were optimized by response surface method.The result showed when the fermentation conditions were certain，the optimum ingredient levels of culture were obtained as follows:1.48%glucose，0.57%defatted soy flour and 0.05%KH2PO4，the alkaline protease activity could reach 1792±47.72294u/mL.On the basis of the culture， initial pH，inoculation amount and temperature were optimized，the optimum fermentation conditions were:pH8.9，inoculation amount 4.9%and 35.4℃.Under these conditions，the protease activity could reach 2401u/mL which was increased by 37%in comparison with the not optimized conditions，and realized the better economic benefits.

Bacillus Subtilis;alkaline protease;response surface method

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0195-06

蛋白酶是一種重要的酶制劑，在輕工、食品、醫藥工業中用途尤為廣泛［1］。蛋白酶按其酶解作用的酸堿條件分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，由于堿性蛋白酶比中性和酸性蛋白酶具有更強的水解能力和耐堿、耐熱性能，被認為是最重要的應用型酶類，在工業酶中用量最大［2］。雖然我國對堿性蛋白酶的研究和利用已有多年的歷史，研究水平不斷提高，但仍主要依賴于進口，存在著酶制劑品種單一、價格昂貴等問題。雖然近年來利用微生物發酵產酶的研究較多，但多以化學分析試劑為主要組成部分，不僅成分較多，成本較高，而且酶活遲遲提高不上去，限制了工業化生產的實現。本實驗以提油后剩余的副產物——低溫脫脂豆粕為主要成分，枯草芽孢桿菌為發酵劑，通過響應曲面法(Response Surface Methodology，RSM)來優化各種條件，在較低成本的前提下，提高了堿性蛋白酶活，為實現工業化大生產提供了依據。

2010-08-12 *通訊聯系人

吳海波(1975-)，女，在讀博士，助理研究員，研究方向:植物油脂與蛋白工程。

黑龍江省科技攻關計劃項目(GA09B401-6)。