對甲基苯甲酸連接的氯霉素全抗原合成與鑒定

羅舜菁，陳婷婷，劉成梅，*，鄒常春，嚴杰琳，陳 臣，高 鵬

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047; 2.南昌大學，江西南昌330031)

對甲基苯甲酸連接的氯霉素全抗原合成與鑒定

羅舜菁1，陳婷婷1，劉成梅1，*，鄒常春2，嚴杰琳1，陳 臣1，高 鵬1

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047; 2.南昌大學，江西南昌330031)

以對氯甲基苯甲酸(CBA)或對氯甲基苯甲酸甲酯(MCB)分別與氯霉素(CAP)反應合成氯霉素-對甲基苯甲酸半抗原(CAP-MBAⅠ、CAP-MBAⅡ)，再與牛血清白蛋白(BSA)偶聯制備全抗原;通過紫外、熒光光譜掃描定性鑒定合成成功;bradford法結合TNBS法定量計算出全抗原表面半抗原密度(HD)。再將CAP-MBAⅡ與卵清蛋白(OVA)合成包被抗原(CAP-MBAⅡ-OVA)，間接競爭ELISA計算其抑制率。研究結果表明，半抗原全抗原偶聯效率優于CAPMBAⅠ，MCB與CAP反應合成的半抗原CAP-MBAⅡ更適合蛋白偶聯。采用CAP-MBAⅡ-OVA作為包被抗原可以提高ELISA檢測的抑制率從而增加其靈敏度。

氯霉素，對甲基苯甲酸，連接臂，全抗原

圖1 氯霉素及其體內主要代謝產物氯霉素糖醛酸的分子結構

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯霉素 BBI公司;對氯甲基苯甲酸、對氯甲基苯甲酸甲酯 強中化工;琥珀氯霉素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、三硝基苯磺酸 sigma公司;bradford蛋白濃度測定試劑盒 碧云天生物技術研究所;其余試劑 均為分析純。

DU 640可見-紫外分光光度計 美國Beckman Coulter公司;F-4500型熒光光度計 日本日立公司;Multiskan MK3酶標儀 美國 Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 半抗原氯霉素-對甲基苯甲酸(CAP-MBA)的合成

1.2.1.1 對氯甲基苯甲酸與氯霉素的反應 稱取66mg CAP溶于4mL DMF與1，4-二氧六環的混合溶液中(1∶1，V/V)，加入34mg對氯甲基苯甲酸，40℃攪拌反應8h，采用硅膠薄層層析(TLC)監測合成反應進行。產物記作CAP-MBAⅠ，真空干燥備用。

1.2.1.2 對氯甲基苯甲酸甲酯與氯霉素的反應 稱取66mg CAP溶于4mL DMF與1，4-二氧六環體積比為1∶1的混合溶液中，加入44mg對氯甲基苯甲酸甲酯，80℃加熱攪拌4h后，加入6mol/L的NaOH溶液0.2mL去甲酯化，室溫反應3h后，離心后取上清液，加入6mol/L的 HCl溶液調節 pH至7，反應10min，采用TLC監測反應進行。產物記作 CAPMBAⅡ，真空干燥備用。

1.2.2 全抗原合成

1.2.2.1 免疫抗原的合成 稱取120mg的 BSA溶于12mL DMF、0.01mol/L PBS、超純水(1∶1∶2，V/V)混合溶液中，得到10mg/mL BSA溶液，置于0℃平衡，此為A液;取1mL 0.5mol/L CAP-HS、CAP-MBAⅠ，CAP-MBAⅡ，分別加入10μL三正丁胺，冰浴條件下攪拌反應10min，加入7μL氯甲酸異丁酯，室溫下攪拌反應1h，作為活化半抗原，記為B液;按CAP與BSA起始摩爾比為40∶1、30∶1、20∶1、10∶1取適量A液放入不同錐形瓶中，將1mL B液逐滴加入到對應的A液中，反應在冰浴中進行，維持pH 8.5，攪拌反應4h，反應液裝入透析袋中，4℃用pH7.4 PBS透析3d，每天換液3次。透析后部分用于檢測及免疫，其余真空冷凍干燥備用。

1.2.2.2 包被抗原的合成 根據本實驗室前期研究結果［13］，按半抗原與OVA起始摩爾比7∶1合成包被抗原CAP-HS-OVA、CAP-MBAⅡ-OVA。具體如下:將一定量CAP-HS和CAP-MBAⅡ溶于0.01mol/L PBS溶液中，分別加入一定量的EDC-HCl和NHS，控制pH在5.0左右，室溫避光振蕩活化15min。加入的一定量β-巰基乙醇淬滅未反應的EDC-HCl。分別加入2mL 10mg/mL OVA溶液，室溫反應2h后，反應液中加入10mmol/L鹽酸羥胺，淬滅未反應的NHS。反應液用pH7.4的0.01mol/L PBS透析3d，透析后部分用于檢測，其余冷凍干燥備用。

1.2.3 全抗原的抗原的鑒定

1.2.3.1 紫外光譜掃描 將半抗原CAP-HS、CAPMBAⅠ、CAP-MBAⅡ，載體蛋白 BSA及全抗原CAP-HS-BSA、CAP-MBAⅠ-BSA、CAP-MBAⅡ-BSA稀釋至合適濃度，在200～400nm處掃描紫外吸收光譜。

1.2.3.2 熒光光譜掃描 設置激發與發射狹縫寬度為5nm，掃描速度為2400nm/min，設置激發波長為280nm，在300～450nm之間掃描BSA及全抗原的發射光譜。

1.2.3.3 全抗原蛋白質濃度及其表面半抗原密度計算 Bradford蛋白濃度測定試劑盒繪制BSA濃度標準曲線，并測定CAP-HS-BSA，CAP-MBAⅠ-BSA，CAP-MBAⅡ-BSA的蛋白質濃度，記作C(bradford);采用TNBS法繪制相應的BSA濃度標準曲線，同時測定三種全抗原的濃度，記作C(TNBS)。根據bradford法及TNBS法測定蛋白質濃度算得全抗原氨基替換率，按每個BSA分子上含有60個自由氨基計算出每個BSA分子上的半抗原密度(hapten density，HD)［14］。

按每個OVA分子上含40個自由氨基計，同法算得包被抗原的半抗原密度。

表1 全抗原的蛋白濃度及表面半抗原密度

1.2.4 不同包被抗原對抗體親和力的影響 CAPHS-OVA，CAP-MBAⅡ-OVA合成后，用間接ELISA檢測2種包被抗原與抗體的親和力。本實驗所用抗體為CAP-HS-BSA免疫小鼠制得的抗氯霉素單克隆抗體。具體如下:CAP-HS-OVA，CAP-MBAⅡ-OVA稀釋至5μg/mL包被酶標板，每孔100μL，4℃靜置過夜后用1%PBST洗滌;加入380μL 3%脫脂牛奶封閉酶標板，37℃溫育1h后洗滌;加入100μL梯度稀釋的抗體，抗體稀釋度為1∶800至1∶51200倍比稀釋，37℃溫育1h后洗滌;加入100μL酶標羊抗小鼠IgG，37℃溫育1h后洗滌;加入100μL TMB顯色液，37℃溫育15min;加入50μL 2mol/L的H2SO4溶液終止顯色，用酶標儀檢測其在450nm處吸光值為陽性值?？贵w滴度OD值為1.0時的抗體稀釋度。

1.2.5 不同包被抗原對ELISA檢測靈敏度的影響采用間接競爭ELISA檢測不同包被抗原對ELISA靈敏度的影響。將1.2.4加梯度稀釋抗體一步改為加入50μL濃度為0、4、10、20、40、100、140、200ng/mL氯霉素標準品及50μL最佳工作濃度的氯霉素單抗，其余步驟同上。計算抑制率(Inhibition Rate)，IR= (1-B/B0)×100%，B為加入競爭品孔的吸光值，B0為競爭品濃度為0的孔的吸光值。半數抑制率IC50為抑制率達到50%時的競爭品濃度。

2 結果與討論

2.1 紫外光譜

通過紫外掃描可知，CAP-MBA、CAP-HS、BSA的最大吸收峰分別在275、276、278nm處(如圖2所示)。與BSA相比，全抗原CAP-HS-BSA、CAPMBAⅠ-BSA、CAP-MBAⅡ-BSA的最大吸收峰發生輕微藍移至277nm，峰形也略有不同。如圖2b、2c所示，隨著半抗原投料量的增加，全抗原的最大吸收峰值逐漸增大?？沙醪脚袛喟肟乖c載體蛋白偶聯成功。

2.2 熒光光譜

如圖3所示，隨著半抗原投料量的增加，CAPHS-BSA、CAP-MBAⅠ-BSA、CAP-MBAⅡ-BSA的熒光強度逐漸下降，最大發射波長逐漸藍移。此現象與紫外檢測結果可共同判斷全抗原偶聯成功。singh等對莠去津全抗原的熒光發射光譜研究也得到相似的結果［15］。這是由于在激發波長為280nm處，蛋白質內源熒光主要由酪氨酸殘基和色氨酸殘基產生。隨著投料量的增加，蛋白質表面半抗原密度的增加，使得酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍環境疏水性增加，熒光強度逐漸減弱，最大吸收波長藍移。

2.3 免疫抗原蛋白質濃度及其表面半抗原密度計算

圖2 BSA、不同半抗原及不同起始摩爾比的各種全抗原的紫外吸收光譜

圖3 270nm處BSA及不同起始摩爾比的全抗原的熒光激發光譜

半抗原密度是全抗原免疫原性的重要影響因素，也對包被抗原的靈敏度有著重要影響。Bradford法是染料與蛋白上的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基結合，使染料的最大吸收峰465nm移至595nm進行測定，對于同種蛋白測量準確，靈敏度高。TNBS法則是測量蛋白質上的自由氨基。先由Bradford法測得蛋白質濃度，與TNBS測得濃度對比即可算出全抗原上的氨基替換率，從而計算半抗原密度。

以bradford法測定BSA濃度標準曲線，得線性回歸方程，y=2.7709x+1.0779，R2=0.9961，以TNBS法測定 BSA濃度標準曲線，y=0.0081x+0.0023，R2=0.9987。

以bradford法測定OVA濃度標準曲線，得線性回歸方程方程，y=2.6980x+0.9539，R2=0.9899，以TNBS法測定 OVA濃度標準曲線，y=0.0043x+ 0.0159，R2=0.9964。包被抗原CAP-HS-OVA，CAP -MBAⅡ-OVA的蛋白濃度分別為6.28、6.34mg/mL，表面半抗原密度分別為3.3、3.1。

2.4 不同包被抗原對ELISA檢測的影響

在450nm處測得間接ELISA的吸光值反映了不同包被抗原對抗體的親和力，包被抗原的表面半抗原密度及包被濃度相同，其余ELISA條件一致的情況下，吸光值越高表示抗體對包被抗原的結合力越好，親和力越高。圖4為間接ELISA中不同包被抗原對應的抗體稀釋曲線。相同抗體稀釋度下，CAPHS-OVA的吸光值高于CAP-MBAⅡ-OVA，由圖計算二者的抗體滴度分別為19314.3和8139.6。CAPMBAⅡ-OVA的半抗原與免疫半抗原具有不同的連接臂，降低了抗體對連接臂部分的識別，因此其對抗體的親和力小于CAP-HS-OVA［16］。

圖4 兩種包被抗原的抗體稀釋曲線

降低ELISA檢測的靈敏度是ELISA方法建立的主要目的。圖5所示為間接競爭ELISA的抑制曲線，達到相同抑制率是，CAP-MBAⅡ-OVA做包被抗原的競爭品濃度低于CAP-HS-OVA。半數抑制率IC50為判斷ELISA靈敏度的重要參數，包被CAPMBAⅡ-OVA和CAP-HS-OVA的ELISA檢測的IC50分別為 18.25ng/mL和 23.97ng/mL。由于 CAPMBAⅡ-OVA與抗體結合力下降，使得氯霉素與抗體作用機會增加，提高對ELISA檢測的抑制率，因此采用CAP-MBAⅡ-OVA做包被抗原提高了ELISA檢測的靈敏度［17］。

圖5 兩種包被抗原的競爭ELISA抑制曲線

3 結論

半抗原設計通常包括了大量復雜的化學合成，本實驗通過簡單的化學合成使CAP分子接上連接臂，制得新的半抗原CAP-MBA，半抗原合成反應后，未反應的對氯甲基苯甲酸遇水析出，可以很方便地除去;而未反應的氯霉素分子不具有羧基，不參與與載體蛋白的偶聯反應，可在全抗原合成反應后通過透析除去。因此本實驗在半抗原合成后，不需要采用紅外、質譜等精確手段鑒定半抗原CAP-MBA，可直接將其用于全抗原合成。全抗原的表面半抗原密度與反應溶液中合成成功的半抗原的含量成正比，因此通過計算全抗原的HD可半定量比較出不同方法合成的半抗原成功率。CAP-MBAⅡ-BSA表面半抗原密度(按起始摩爾比不同分別為15.0、6.6、3.3、1.7)略低于CAP-HS-BSA(17.4、11.2、4.7、3.7)，而遠遠高于CAP-MBAⅠ-BSA(6.4、2.6、2.3、0.2)。因此，通過將實驗合成的CAP-MBA半抗原與商品化的CAP-HS比較可以得出，以對氯甲基苯甲酸合成的CAP-MBAⅠ合成效果稍差，以對氯甲基苯甲酸甲酯合成的CAP-MBAⅡ成功率較高，可用于全抗原合成。

在ELISA檢測中，通過對半抗原連接位點，連接臂長度，結構等進行合理選擇與搭配，可以有效地利用可預測的交叉反應，達到同時檢測某一族化合物的目的，并且可以抑制不可預測的交叉反應，提高檢測的特異性［18］。本實驗合成半抗原CAP-MBA與琥珀氯霉素相比，連接臂連接位點相同，結構和長度不同，是理想的驗證不同連接臂對ELISA檢測靈敏度的半抗原。使用CAP-HS-BSA免疫小鼠獲得的抗體比較包被抗原CAP-HS-OVA與CAP-MBAⅡ-OVA對ELISA檢測的影響。以CAP-MBAⅡ-OVA為包被抗原親和力較弱(抗體滴度為8139.6低于CAP-HS-OVA的19314.3)，但能提高ELISA檢測的靈敏度(IC5018.25ng/mL低于 CAP-HS-OVA的23.97ng/mL)。這是由于通過選用含不同連接臂的包被抗原，可以消除識別連接臂部分抗體的干擾，從而降低抗體與包被抗原間的非特異性結合，使得競爭品對抗體與包被抗原結合的抑制率增加，達到提高ELISA靈敏度的效果，與Kim等［8］報道一致。

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Synthesis and characterization of chloramphenicol complete antigen linked by 4-methylbenzoic acid

LUO Shun-jing1，CHEN Ting-ting1，LIU Cheng-mei1，*，ZOU Chang-chun2，YAN Jie-lin1，CHEN Chen1，GAO Peng1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China; 2.Nanchang University，Nanchang 330031，China)

A new Chloramphenicol(CAP)hapten was prepared by conjugate CAP with 4-(Chloromethyl)benzoic acid(CBA)or Methyl 4-(chloromethyl)benzoate(MCB).Two types of hapten(CAP-MBAⅠ，CAP-MBAⅡ)were used to synthesis complete antigen(CA)with BSA.CA was identified by UV and florescence spectrum.The hapten density of CA was evaluated by Bradford method together with TNBS method.CAP-MBAⅡwas then linked to OVA forming Solid-coating antigen(CAP-MBAⅡ-OVA).The results showed that MCB conjugated with CAP was better than CBA.CAP-MBAⅡ-OVA can rise the inhibit rate of ELISA and sensitivity can be improved.

chloramphenicol;4-methylbenzoic acid;linking arm;complete antigen

TS201.2

A

1002-0306(2011)03-0200-05

氯霉素(chorampheulcol，CAP)及其體內代謝物氯霉素糖醛酸殘留具有血液系統毒性，可導致不可逆的再生障礙性貧血，嚴重危害人類健康［1］。因此，美國、歐盟等諸多國家規定禁止氯霉素用于食源性動物，并將氯霉素列為必檢項目，規定不得檢出［2-3］。近年來，熒光偏振免疫分析［4］、基于表面等離子共振的生物傳感器［5］等新興免疫技術越來越多地運用到動物性食品的氯霉素檢測領域，酶聯免疫分析(ELISA)［6］、免疫層析［7］等傳統免疫檢測手段也在不斷改進。氯霉素全抗原的研究作為免疫分析的核心對于提高氯霉素檢測的靈敏度及準確性，提高食品中氯霉素的現場檢測速度及準確度有重要的意義。異源性ELISA檢測中免疫半抗原與包被半抗原的差異性越大，抗體對包被抗原的識別減弱，使得待測物能與抗體結合作用機會增加，與包被抗原充分競爭，從而能檢測較低濃度的待測物，從而提高ELISA檢測的靈敏度［8-9］。因此，本研究擬采用一種新的連接臂對ELISA檢測靈敏度的影響。在氯霉素全抗原的制備中一般采用的偶聯方法有混合酸酐法［10］、重氮化法、碳化二亞胺法［11］和羰基二咪唑法［12］等。本實驗擬采用對氯甲基苯甲酸［4-(Chloromethyl)benzoic acid，CBA］或對氯甲基苯甲酸甲酯［Methyl 4-(chloromethyl)benzoate，MCB］與氯霉素合成氯霉素-對甲基苯甲酸(CAP-MBA)半抗原，選用BSA做載體蛋白，初步探索對氯甲基苯甲酸(CBA)作為連接臂合成氯霉素全抗原的方法及條件。再按照優化的方法合成包被抗原，比較氯霉素-對甲基苯甲酸(CAP-MBA)半抗原與氯霉素琥珀酸酐(CAP-HS)半抗原對ELISA檢測靈敏度的影響。

2010-11-10 *通訊聯系人

羅舜菁(1969-)，女，副教授，碩士，研究方向:食品安全。

江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ09062)。