酶法水解魷魚皮制備多肽工藝的研究

林 燕，王鴻飛，李和生，劉 飛，毛方華

(寧波大學生物工程與生命科學學院，浙江寧波315211)

酶法水解魷魚皮制備多肽工藝的研究

林 燕，王鴻飛*，李和生，劉 飛，毛方華

(寧波大學生物工程與生命科學學院，浙江寧波315211)

分析了阿根廷魷魚皮的一般化學組成，并以其為原料，研究了酶的種類、加酶量、pH、溫度及酶解時間對水解度(DH)的影響。采用正交實驗對酶解工藝進行了優化，研究結果表明，復合蛋白酶水解魷魚皮制備多肽工藝的最適條件為:加酶量14000u/g、pH8.5、酶解溫度50℃、酶解時間4h。在此條件下水解度可達20.7%。

魷魚皮，酶解工藝，優化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魷魚 阿根廷魷魚，購自寧波江東水產市場，重量150～200g;木瓜蛋白酶(測定活力6.32×104U/g)、堿性蛋白酶(測定活力19.21×104U/g)、胃蛋白酶(測定活力3.56×104U/g) 上?？笊锕こ逃邢薰?中性蛋白酶(13.08×104U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司;復合蛋白酶(測定活力12.97× 104U/g) 廣州友志貿易有限公司;牛血紅蛋白(BR) 上海藍季科技發展有限公司;其他試劑 均為分析純。

Cary-50紫外分光光度計 美國VARIAN公司; T6-新悅可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;WK-200B高效藥物粉碎機 山東精誠機械有限公司;CS101-1AB電熱鼓風干燥箱 重慶銀河實驗儀器有限公司;KDN-04消化爐 上海新嘉電子有限公司;SX2-4-10馬弗爐 上海躍進醫療器械廠;R-201旋轉蒸發儀 上海申順生物科技有限公司;DK-S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;PB-10pH計、BP-211D電子天平 德國sartorius公司;SZCL型數顯智能控溫磁力攪拌器鞏義市中博儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 魷魚皮粉→溶解→加酶酶解→滅酶→冷卻→多肽液

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 原料前處理 魷魚皮剪成小塊置于鐵絲網上，于50℃下鼓風烘干12～15h，最終水分含量控制在4.5%～5%，經高效藥物粉碎機粉碎(1min/批)，得魷魚皮粉，密封于干燥器中，待用。

1.2.2.2 酶解 通過預實驗，確定底物濃度為4%。稱取一定量魷魚皮粉，溶解使底物濃度為4%，根據底物質量加酶，振蕩混勻后在一定條件下酶解，酶解完成后沸水浴滅酶10min，冷卻定容并進行水解度的測定。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 蛋白酶的選擇 選取木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶，根據其活力選擇不同的添加量，在各自最適的酶解條件下進行酶解，以水解度為指標確定最適的水解用酶。

1.2.3.2 加酶量的選擇 每克底物分別添加8000、10000、12000、14000、16000、18000u的酶量，在pH6.5、溫度45℃的條件下酶解4h，然后測定水解度，綜合選定最適酶用量。

1.2.3.3 pH的選擇 分別調節酶解體系pH為7.0、8.0、8.5、9.0、9.5，在45℃條件下酶解4h，測定水解度并確定最適pH。

1.2.3.4 溫度的選擇 在前面確定的最適條件下分別在40、45、50、55、60℃條件下酶解4h，確定最適酶解溫度。

1.2.3.5 酶解時間的選擇 對于選定的最適水解用酶，在相同的水解條件下酶解2、3、4、5、6h以確定最適酶解時間。

1.2.4 正交實驗 在單因素實驗的基礎上采用正交實驗對酶解工藝進行優化，其因素與水平見表1，按L9(34)正交表進行正交實驗。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.5 測定方法

1.2.5.1 基本成分測定 總氮含量測定:凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2003);水分含量測定:直接干燥法(GB/T 5009.3-2003);灰分含量測定:灼燒重量法(GB 5009.4-85);脂肪含量測定:索氏抽提法(GB/T 14772-2008)。

1.2.5.2 酶活力測定 福林-酚法。其中，木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶按SB/T 10317-1999測定;胃蛋白酶按中國藥典2000版(第二部)測定。

1.2.5.3 水解度(DH)測定［14］甲醛電位滴定法。以游離氨基氮占總氨基氮的含量表示水解度，其公式為DH(%)=游離氨基酸氮總量/總氨基氮×100%

2 結果與討論

2.1 魷魚皮的基本成分

魷魚皮的基本成分見表2。魷魚皮中含有大量水分，其干物質主要成分是蛋白質。通過測定其粗蛋白含量為73.9%(以干基重計)。

表2 魷魚皮的一般化學組成(濕基)

2.2 蛋白酶的選擇

分別在每一種酶的適宜條件下進行酶解實驗，結果見表3。

表3 不同酶的酶解效果酶種類 溫度(℃) pH 水解度DH(%)

從表3可以看出，各種酶的水解程度為:復合蛋白酶＞中性蛋白酶＞胃蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶，其中復合蛋白酶的水解程度明顯高于其余四種酶，木瓜酶水解度較低。因此，選用復合蛋白酶進行酶解工藝的水解用酶。

2.3 酶量對水解度的影響

根據選酶實驗結果，選取復合蛋白酶進行后續實驗。在pH6.5、溫度45℃、酶解時間4h的條件下，研究不同酶量對水解度的影響，結果見圖1。

圖1 復合蛋白酶加酶量對水解度的影響

由圖1可知，當復合酶量小于14000u/g時，隨著酶量的增加，水解度不斷升高;當復合酶量大于14000u/g后，水解度基本保持不變。

在酶法制取魷魚皮多肽時，酶的用量對魷魚皮蛋白的水解程度有顯著的影響。一般地，隨酶用量的增加水解程度也隨之增加;但當水解到一定程度時，隨底物濃度的下降、酶量的增加，水解度再不會提高。由圖1表明，較小酶用量14000u/g時，就可達到較好的水解效果。

2.4 pH對水解度的影響

在加酶量14000u/g、溫度45℃、酶解時間4h的條件下，研究不同pH對水解度的影響，結果見圖2。

圖2 pH對水解度的影響

由圖2可知，酶解體系的pH對酶解效果有顯著的影響。因為pH的大小直接影響酶的活力，每一種酶都有其適宜的pH范圍。當pH小于8.5時，隨pH的升高水解度增加;當pH大于8.5時，隨pH的升高水解度降低;pH8.5時，水解度最高。表明復合蛋白酶在pH8.5時的弱堿性條件下對魷魚皮蛋白的水解達到了一個較好的效果，在過酸或過堿的環境下，復合蛋白酶的活性會受到不同程度的抑制，此外，不適宜的pH環境還會影響酶與其底物的結合，也會影響水解效果。

2.5 溫度對水解度的影響

在加酶量14000u/g、pH8.5、酶解時間4h的條件下，研究不同溫度對水解度的影響，結果見圖3。

圖3 溫度對水解度的影響

由圖3可知，溫度對酶解效果有較顯著的影響。不但影響水解反應，而且影響酶的活力。當溫度低于50℃時，隨溫度的增加水解程度增高;當大于50℃時，水解度有所降低;在50℃時，有較高的水解度。在用復合蛋白酶水解魷魚皮蛋白時，可選用溫度50℃作為水解溫度。

2.6 酶解時間對水解度的影響

在加酶量14000u/g、pH8.5、溫度50℃的條件下，研究不同酶解時間對水解度的影響，結果見圖4。

一般地，隨著作用時間的增加，水解度不斷增加;但當達到一定時間后，隨底物濃度的下降、水解產物的積累，水解度增加的程度變得不明顯，為提高經濟效益，此時為酶解最少的作用時間。由圖4表明，在酶作用時間4h以下時，隨時間的延長，水解度增高;當4h以后，水解度基本保持不變;在用復合蛋白酶水解魷魚皮蛋白時，可選用4h為酶解時間。

圖4 酶解時間對水解度的影響

2.7 酶解工藝條件的優化

在單因素實驗的基礎上采用正交實驗對酶解工藝進行優化，按L9(34)正交表進行正交實驗，正交實驗的結果見表4。

表4 復合蛋白酶水解魷魚皮正交實驗的結果與分析

由極差分析(R值)可得，四個因素對復合蛋白酶水解度的影響依次為:B＞C＞A＞D，優化所得條件為:B2C2A3D2，即 pH8.5、溫度 50℃、加酶量18000u/g、時間4h。但從極差分析的三個平均值(K值)來看，加酶量的后兩個水平相差很小，也就是說增加4000u的酶量對其水解度的影響幾乎可忽略不計，從經濟上考慮，仍然選擇14000u/g作為復合酶水解工藝的最適加酶量，在此條件下酶解魷魚皮所得水解度為20.7%。

3 結論

對阿根廷魷魚皮的一般組成進行了測定并對其酶解工藝進行了研究。通過酶的選擇，確定了復合蛋白酶作為適合的魷魚皮制取多肽用酶。通過單因素及正交實驗，研究表明，復合蛋白酶酶解魷魚皮的最適工藝條件為:pH8.5、溫度50℃、加酶量14000u/g(干基)、水解時間4h，在此條件下能得到較高的水解度。

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Study on the enzymatic hydrolysis technology of squid skin(Illex argentinus)peptides

LIN Yan，WANG Hong-fei*，LI He-sheng，LIU Fei，MAO Fang-hua
(College of Bioengineering and Life Science，Ningbo University，Ningbo 315211，China)

General chemical composition of squid skin(Illex argentinus)were analyzed.The effects such as enzyme kind，protease dose，pH，hydrolysis temperature and hydrolysis time on degree of hydrolysis(DH)of squid skin were investigated.The enzyme hydrolysis technology condition was optimized by orthogonal testing.The results showed that the feasible enzyme hydrolysis technology conditions were that the protamex protease dose 14000u/g，pH8.5，hydrolysis temperature 50℃and hydrolysis time 4h，from which the hydrolyzed degree of the squid skin was 20.7%.

squid skin;enzymolysis technology;optimization

TS254.1

A

1002-0306(2011)03-0204-04

近年來，隨著我國遠洋魷釣業的迅速發展，魷魚日益成為我國主要的海洋經濟軟體動物和水產品加工原料，僅2005年我國魷魚捕獲量就達40～50t。目前，我國魷魚加工利用技術含量較低，生產中產生的頭、內臟、皮等大多都被作為廢棄物丟棄、掩埋，不但造成了資源的浪費，而且還污染了環境。因此，如何加工利用這些廢棄物，提高漁業的附加值，增加漁民的收入，就成為亟待解決的熱點問題。對于水產動物皮的價值以及利用在國內外都已有不少研究報道。無論是在魚皮制革［1-2］、作為蛋白質新資源［3-7］還是其他生物活性物質提取與利用等［8-10］方面，都顯示出水產動物皮的誘人經濟價值與前景。魷魚皮的膠原蛋白含量較高，約占干重的80%［11］。據報道，膠原多肽的吸收率幾乎達100%，且具有抗潰瘍、降血壓、促進 Ca2+吸收等多種生物學活性［12］。B.Giménez等［6］通過對魷魚皮多肽的抗氧化性及其他理化性質的研究，表明其對Fe2+的螯合能力、ABTS自由基的清除能力等有顯著的效果。Eresha Mendi等［13］也對秘魯魷魚皮明膠多肽進行了體外抗氧化性的研究，發現其水解物本身就已經顯示出了很強的甚至比天然抗氧化劑維生素E還要高很多的脂質抗氧化能力，此外其研究小組還分離出了兩種具有強抗氧化能力的小肽并對其序列進行了測定。對于多肽的獲取或蛋白質的利用，酶解工藝相對于其它工藝來講具有簡單、安全、經濟的特點而被廣泛采用。本文以魷魚皮為原料，采用酶法水解工藝，對酶進行選擇，通過單因素與正交實驗確定酶解的適宜條件，以期制取魷魚皮多肽，為魷魚皮多肽的加工提供理論基礎及工藝參數。

2010-03-25 *通訊聯系人

林燕(1986-)，女，碩士研究生，研究方向:食品科學。

浙江省科技廳(2009C03017-3);寧波大學科研基金(xkl123)。