從肝素生產廢棄物中分離純化硫酸皮膚素

郭 睿，曹雁平，施 宇，曹 楊，張 婷

(1.北京工商大學化學與環境工程學院，北京100048; 2.北京工商大學北京市高校食品添加劑與配料工程研究中心，北京100048)

從肝素生產廢棄物中分離純化硫酸皮膚素

郭 睿1，曹雁平2，*，施 宇1，曹 楊1，張 婷1

(1.北京工商大學化學與環境工程學院，北京100048; 2.北京工商大學北京市高校食品添加劑與配料工程研究中心，北京100048)

篩選了乙醇、丙醇、丙酮三種有機試劑對肝素生產廢棄物進行分級沉淀，對比了添加鈉離子濃度對分級沉淀的影響。凝膠成像儀對各沉淀級分的醋酸纖維素薄膜電泳結果進行分析，確定了各級分的黏多糖構成比例，表明丙酮法級分14和15的硫酸皮膚素含量占黏多糖組成比例的100%，隨后通過DEAE-650S弱離子交換層析進一步分離，得到了高純度的硫酸皮膚素，高效凝膠滲透色譜法測定該產品純度為93.27%。

分級沉淀，硫酸皮膚素，離子交換層析，黏多糖，分離純化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肝素生產廢棄物 高安市，江西時通實業有限公司;乙醇、丙醇、丙酮、氯化鈉、三氯甲烷、甲醇 分析純，北京試劑;甲苯胺藍、阿利新藍8GX 分析純，Amresco;醋酸纖維素薄膜(7cm×9cm) 北京六一廠;TOYOPEARL DEAE-650STOSOH公司;硫酸皮膚素、肝素、硫酸軟骨素標準品 Sigma公司。

CR 22G高速冷凍離心機 日本Himac;DYCP-38B電泳儀 北京六一廠;Alliance 2695高效液相色譜儀 美國Waters公司;ImageQuant 300凝膠成像儀、AKTA prime蛋白純化系統 美國GE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理［6］將生產肝素廢液用乙醇沉淀、干燥并粉碎，按固液比1∶25加入脫脂液甲醇/三氯甲烷(V/V，1∶1)，攪拌24h后真空抽濾，保留固體，凍干。取凍干固體，用去離子水按固液比1∶10充分溶解，12000r/min，20℃離心15min，保留上清液，向上清液中加入3V體積的無水乙醇，4℃靜置24h，12000r/min，20℃離心20min，保留沉淀，凍干。

1.2.2 分級沉淀有機試劑的篩選 有機試劑沉淀法作為純化生物大分子物質的一種經典方法，選擇有機溶劑時應能和水混溶，使用較多的有機溶劑如乙醇、丙醇、丙酮等，為避免生物活性大分子變性失活，沉淀應在低溫下進行。

分別選取乙醇、丙醇和丙酮作為沉淀劑，取預處理后的樣品按固液比1∶10溶解于去離子水中，加入0.1V體積的沉淀劑，搖勻20min，4℃密封靜置24h。離心12000r/min，20min，4℃，取出沉淀并用20mL去離子水沖洗、凍干。再向上清液中加入0.1V原溶液體積的沉淀劑，重復上述操作，直至加入沉淀劑時連續5次無沉淀產生。取各次沉淀溶解后進行醋酸纖維素薄膜電泳檢測。

1.2.3 鈉離子濃度對分級沉淀的影響 考慮到溶液中金屬離子濃度可能對分級沉淀的級分數量、各級分回收率和黏多糖組成比例產生影響，本文選取了添加2%的NaCl(濃度)進行對比。分別選取乙醇、丙醇和丙酮作為沉淀劑，在第一次加入沉淀劑前向溶解后的樣品中添加2%的NaCl(濃度)溶解，之后步驟同1.2.2。

1.2.4 各沉淀級分黏多糖組成分析

1.2.4.1 醋酸纖維素薄膜電泳［7-8］采用醋酸纖維素薄膜電泳法對不同級分的黏多糖組成進行分析，條件為0.1mol/L乙酸鋇緩沖液(pH8.6)，電壓100V、電流4mA，電泳時間3h。電泳完畢后，用0.1%甲苯胺藍溶液染色30min，1%醋酸脫色30min。

1.2.4.2 黏多糖組成比例分析［9-10］采用 GE IQ300凝膠成像儀對電泳結果進行成像，使用IQ TL軟件對電泳結果進行分析，確定不同級分的黏多糖組成比例。條件為apture4，zoom15，focus1.2，auto contrast。

1.2.5 離子交換層析與洗脫液DS的監測 離子交換層析可以使分級沉淀法得到的單一黏多糖組分進一步純化，陽離子染料阿利新藍8GX可以與硫酸皮膚素聚陰離子發生特異反應，引起染料吸收光譜的變化，從而可以用于洗脫時硫酸皮膚素的監測。

1.2.5.1 離子交換層析［11-12］選用DEAE-650s弱陰離子交換樹脂裝柱，洗脫液A為超純水，洗脫液B為2mol/L NaCl溶液，用A液平衡柱子，將沉淀法得到的單一DS組分樣品溶解，上樣，洗脫條件為100%A至100%B梯度洗脫，洗脫時間 400min，流速1mL/min，收集6min/管。

1.2.5.2 洗脫液DS的監測［13-14］配制阿利新藍8GX溶液:275mg阿利新藍8GX溶解于15%磷酸-2%硫酸中，定容至250mL。洗脫液取樣0.2mL，加入1.4mL 8GX溶液和1.2mL去離子水，混勻，靜置5min，于480nm下測定吸光值。

將峰所在的管數合并，透析脫鹽，凍干，進行HPGPC純度測定。

1.2.6 純度測定［14-15］硫酸皮膚素純度測定采用HPGPC高效凝膠滲透色譜法。色譜柱為TSK Gel 4000PWXL(7.5mm ID×30cm L)，流動相100%超純水，進樣量20μL，柱溫箱30℃，流速0.4mL/min，示差折光檢測器(Waters 2414)，檢測器溫度35℃。

2 結果與討論

2.1 分級沉淀黏多糖的有機試劑篩選結果

2.1.1 乙醇法 通過乙醇法對處理后的原料進行分級沉淀，所得到的各級分電泳圖見圖1～圖3。經過凝膠成像儀和IQ TL軟件分析得到了乙醇法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例，見圖4。

圖1 乙醇法分級沉淀電泳圖注:從左至右分別為0.7、0.8、0.9、1.0、1.1V，標品混合樣。

圖2 乙醇法分級沉淀電泳圖注:從左至右分別為1.2、1.3、1.4、1.5、1.6V，標品混合樣。

圖3 乙醇法分級沉淀電泳圖注:從左至右分別為1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2V，標品混合樣。

圖4 乙醇法各級沉淀HEP、CS、DS所占黏多糖組分比例

2.1.2 丙醇法 通過丙醇法對處理后的原料進行分級沉淀，所得到的各級分電泳圖見圖5。經過凝膠成像儀和IQ TL軟件分析得到了丙醇法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例，見圖6。

2.1.3 丙酮法 通過丙酮法對處理后的原料進行分級沉淀，所得到的各級分電泳圖見圖7～圖9。經過凝膠成像儀和IQ TL軟件分析得到了丙酮法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例，見圖10。

圖5 丙醇法分級沉淀電泳圖注:從左至右分別為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1V，標品混合樣。

圖6 丙醇法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例

圖7 丙酮法分級沉淀電泳圖注:從左至右分別為0.7、0.8、0.9、1.0、1.1V，標品混合樣。

圖8 丙酮法分級沉淀電泳圖注:從左至右分別為1.2、1.3、1.4、1.5、1.6V，標品混合樣。

圖9 丙酮法分級沉淀電泳圖注:從左至右分別為1.7、1.8、1.9、2.0、2.1V，標品混合樣。

2.1.4 乙醇、丙醇、丙酮法各級分回收率變化 將乙醇、丙醇、丙酮法的各級分回收率作圖，見圖11。

圖10 丙酮法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例

圖11 各級分回收率變化圖

2.1.5 數據分析 由圖4、圖11得出，乙醇法在0.1～0.6V時未產生沉淀。HEP在乙醇法中首先沉淀的是黏多糖，第6、7、8次級分，HEP的含量占三種黏多糖總量的100%，而隨后10～22次級分中，HEP含量逐步下降，最終消失。DS、CS在各級分中含量的變化則相對較小。2.1V時得到了所有級分中CS含量的最高值73.6%。

由圖11可知，丙醇法所得級分數量較少，在0.1～0.5V以及1.2V以后均不產生沉淀。未能得到某種單一黏多糖含量較高的級分，所得級分的數量可能和三種黏多糖的分離能力成反比。

由圖10、圖11可知，丙酮法在0.1～0.6V沒有沉淀產生，0.7～0.8V小范圍區間時得到了比例為100%的HEP，1.4～2.1V之間HEP含量保持在較低范圍內，1.4～1.5V的小范圍區間內得到了比例為100%的DS，回收率分別為2.6%和2.5%。該法的主要級分回收集中在1.1～1.6V，該區間回收率達到總有效回收率的88.3%。

乙醇法所生成沉淀次數明顯多于丙醇法和丙酮法，乙醇法、丙醇法、丙酮法分別在1.3、0.8、1.1V時沉淀量達到最大值，乙醇法的總回收率76.1%略高于丙酮法的73.7%和丙醇法的72.7%。

2.2 鈉離子濃度對分級沉淀的影響

2.2.1 乙醇法 通過向沉淀前原溶液中添加鈉離子濃度，使用乙醇法對處理后的原料進行分級沉淀，所得到的各級分電泳圖見圖12。經過凝膠成像儀和IQ TL軟件分析得到了乙醇法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例，見圖13。

2.2.2 丙醇法 通過向沉淀前原溶液中添加鈉離子濃度，使用丙醇法對處理后的原料進行分級沉淀，所得到的各級分電泳圖見圖14。經過凝膠成像儀和IQ TL軟件分析得到了丙醇法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例，見圖15。

2.2.3 丙酮法 通過向沉淀前原溶液中添加鈉離子濃度，使用丙醇法對處理后的原料進行分級沉淀，所得到的各級分電泳圖見圖16。經過凝膠成像儀和IQ TL軟件分析得到了丙酮法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例，見圖17。

圖12 乙醇法分級沉淀電泳圖注:從左至右分別為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0V，標品混合樣。

圖13 乙醇法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例

圖14 丙醇法分級沉淀電泳圖注:從左至右分別為0.6、0.7、0.8、0.9V，標品混合樣。

圖15 丙醇法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例

圖16 丙酮法分級沉淀電泳圖注:從左至右分別為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1V，標品混合樣。

2.2.4 乙醇、丙醇、丙酮法各級分回收率變化 將乙醇、丙醇、丙酮法的各級分回收率作圖，見圖18。

圖17 丙酮法各級沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖組分比例

圖18 各級分回收率變化圖

2.2.5 數據分析 由圖13、圖15、圖17、圖18可知，乙醇法在0.1～0.5V時未產生沉淀。0.6～1.0V時，級分中HEP的比例呈較明顯的下降趨勢，而CS則呈較明顯的上升趨勢。丙醇法所得級分數量最少，從0.6～0.9V，僅為4次。丙酮法在0.1～-0.5V不產生沉淀，未能得到組分單一的黏多糖，在0.6V時得到CS的含量占三種黏多糖總量的68%。

可見，溶液中的鈉離子濃度對有機試劑分級沉淀法分離黏多糖分離效果的影響很大。在分離純化應用過程中應該避免金屬離子濃度對分離效果的負面影響，金屬離子濃度不宜過高，以提高分離效果。

將三種方法各級分回收率作圖，見圖12。乙醇法、丙醇法、丙酮法所生成沉淀次數相差不多，但乙醇法和丙酮法均比不添加鈉離子濃度時減少一半以上。三種方法分別在0.7、0.7、0.6V時沉淀量達到最大值，乙醇法的總回收率83.9%略高于丙酮法的81.9%和丙醇法的80.3%，均比不添加鈉離子濃度的總回收率要高，這可能是由于沉淀次數的減少，減少了在清洗沉淀時所不可避免的損失量。

2.3 討論

有機溶劑的沉淀機理是降低水的介電常數，導致具有表面水層的黏多糖脫水，相互聚集，最后析出。采用有機試劑分級沉淀法進行分離純化時，每一級分的得率和黏多糖組成比例都會有所不同，這可能是由于三種黏多糖的結構不同或所帶電荷密度不同與空間結構的差異，或不同多聚糖在不同有機試劑以及不同濃度有機試劑中的溶解飽和度不同。

同時，在比較金屬離子對分級沉淀的結果影響時，選取了鈉離子作為比較，在初始溶液中添加一定鈉離子濃度時，三種沉淀法所得到的級分數量不同，產生沉淀的次數減少近一倍，這可能是由于溶液中鈉離子濃度的提高，降低了溶液的飽和濃度，加速了糖胺聚糖的沉淀，卻降低了沉淀法的分離能力，未能得到單一含量較高的HEP、DS或CS。

2.4 標準品與原料的醋酸纖維薄膜電泳分析結果

將預處理后的原料、HEP標品、DS標品、CS標品以及三種標品的混合樣進行醋酸纖維薄膜電泳后分析(圖19)，原料中所含三種黏多糖，其比例為HEP 30.9%，DS 33.7%，CS 35.4%。同時也驗證了該電泳方法可以很好地將三種黏多糖分離開，CS的遷移速度最快，HEP最慢，而DS則介于兩者之間。

圖19 標準品與原料電泳圖注:從左至右分別為原料、HEP標品、DS標品、CS標品、標品混合樣。

2.5 離子交換層析結果

離子交換樹脂通過吸附與自身帶電荷相反的物質，隨后逐步改變洗脫液的離子強度，使之與樹脂親和力大小不同的物質得以分離。弱離子交換樹脂可以很好地吸附硫酸皮膚素類的糖胺聚糖物質，并在高離子濃度時被洗脫下來。通過梯度提高洗脫液的離子濃度，被吸附的硫酸皮膚素在第8～16管內被洗脫(圖20)，即所對應的洗脫濃度為0.24～0.48mol/L NaCl時，洗脫液中DS與阿利新藍8GX發生特異反應，引起溶液吸光值上升，證明硫酸皮膚素在該區間內被洗脫下來，同時也去除了與樹脂親和力更強或更弱的雜質。

圖20 離子交換層析-阿利新藍8GX顯色分光光度圖

2.6 硫酸皮膚素純度測定結果

通過HPGPC高效凝膠滲透色譜譜圖(圖21)可以看出，純化后硫酸皮膚素的純度為93.27%，在T= 28.647s和T=31.563s時出現兩個小峰，表明硫酸皮膚素中夾帶少量小分子物質，這可能是其自身降解生成的不飽和二糖，也可能是由于該類物質的吸水作用，存在著少量含羧基和硫酸基的小分子無機鹽。因此通過譜圖可進一步確定該樣品為純的硫酸皮膚素。

3 結論

實驗得到了使用丙酮作為有機試劑進行分級沉淀，原料1∶10固液比水溶解，0.1V丙酮添加增量，4℃沉淀24h，級分14與15中DS含量占黏多糖組分的100%，隨后在DEAE-650S離子交換層析中收集0.24～0.48mol/L NaCl洗脫液，透析并凍干，可得到純度為93.27%的DS，是一種有效的手段。同時完成了乙醇法、丙醇法和丙酮法沉淀各級分糖胺聚糖的組分構成鑒定與添加鈉離子濃度對純化的影響，表明純化時金屬離子濃度不宜過高。以后研究重點可集中在如何分離出高純度的硫酸軟骨素，以及如何使目標產物的回收率提高。

圖21 HPGPC高效凝膠滲透色譜譜圖

［1］姬勝利，杜海燕，遲延青.硫酸皮膚素的生物學功能［J］.中國生化藥物雜志，2005，26(1):46-51.

［2］王祥洪，張世娜，劉江濤.溴代十六烷基吡啶光譜探針RRS法測定硫酸皮膚素［J］.化學研究與應用，2009，21(2): 312-316.

［3］F N Lamari，M Militsopoulou，T N Mitropoulou，et al.Analysis of Brown，glycosaminoglycan-derived disaccharides in biologic samples by capillary electrophoresis and protocol for sequencing glycosaminoglycans［J］.Biomedical Chromatography，2002，16 (2):95-102.

［4］E L Wooten，R M Johnson，B J Iozzo，et al.Resistance to Lyme disease in decorin-deficient mice［J］.Journal of Clinical Investigation，2001，107(7):845-852.

［5］JM Trowbridge，RL Gallo.Dermatan sulfate:New functions from an old glycosaminoglycan［J］.Glycobiology，2002，12(9): 117-125.

［6］Jordi Folch，M Lees，G H Cloaane Stanley.A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues［J］.Journal of Biological Chemistry，1957，226(1): 497-509.

［7］E Wessler.Analytical and preparative separation of acidic glycosaminoglycans by electrophoresis in barium acetate［J］. Analytical Biochemistry，1968，26(3):439-444.

［8］Rainer Domanig，Wolfgang J?bstl，Silvia Gruber，et al.Onedimensional cellulose acetate plate electrophoresis—A feasible method for analysis of dermatan sulfate and other glycosaminoglycan impurities in pharmaceutical heparin［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，49: 151-155.

［9］Nicola Volpi，Francesca Maccari.Electrophoretic approaches to the analysis of complex polysaccharides［J］.Journal of Chromatography B，2006，834:1-13.

［10］ Nicola Volpi. Electrophoresis Separation of Glycosaminoglycans on Nitrocellulose Membranes［J］.Analytical Biochemistry，1996，240:114-118.

［11］Y Kato，K Nakamura，T Hashimoto.Evaluation of conventional and medium-performance anion exchangers for the separation of proteins［J］.Journal of Chromatography，1982，253: 219-225.

［12］蘇現波，劉安軍.羊軟骨粘多糖提取與分離［J］.食品科學，2004，25(5):99-102.

［13］熊雙麗.豬喉軟骨硫酸軟骨素的制備和抗氧化、降血脂機理研究［D］.無錫:江南大學，2006.

［14］張虹，廖文娟.鮟鱇魚皮硫酸皮膚素的提?。跩］.食品與發酵工業，2009，35(2):166-171.

［15］Shirley C.Churms.Modern Size-Exclusion Chromatography of Carbohydrates and Glycoconjugates［J］.Journal of Chromatography Library，1995，58:233-265.

Purifying dermatan sulfate from the waste in heparin production

GUO Rui1，CAO Yan-ping2，*，SHI Yu1，CAO Yang1，ZHANG Ting1
(1.College of Chemical and Environmental Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China; 2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing 100048，China)

Ethanol，propanol and acetone were screened in organic reagents fractional precipitation of the waste in heparin production，the addition of sodium ion concentration was also compared.Gel imaging system was used in analyzing the result of each fraction in fractional precipitation after cellulose acetate membrane electrophoresis and the composition of glycosaminoglycan in each fraction was identified.It indicated that 100%DS in GAGs percent was obtained in 14th and 15th fraction.After the purification of DEAE-650S weak ion-exchange chromatography，high purity of DS was obtained.The results of HPGPC showed purity of the product was 93.27%.

fractional precipitation;dermatan sulfate;ion-exchange chromatography;glycosaminoglycan; purification

TS201.2

B

1002-0306(2011)03-0224-06

硫酸皮膚素(dermatan sulfate，DS)，廣泛存在于哺乳動物的結締組織、皮膚、纖維軟骨等組織中［1］。硫酸皮膚素的主體是由L-艾杜糖醛酸和N-乙?；肴樘前?4-硫酸所形成的二糖單位的重復結構［2］，屬于黏多糖(即糖胺聚糖，glycosaminoglycan，GAGs)的一種。其它糖胺聚糖類物質還包括肝素(heparin，HEP)和硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)等［3］。這些黏多糖均具有抗凝血［1］、抗炎［4］、抗腫瘤［5］等生物學活性。肝素生產廢棄物往往被丟棄，從中分離純化硫酸皮膚素不僅可以提高生產的附加價值，還能避免原材料的浪費，減少對環境的污染。與特異酶降解法、強陰離子交換層析法、季銨鹽化合物沉淀法等傳統分離黏多糖方法相比，有機試劑分級沉淀結合弱陰離子交換色譜法，不僅降低了制備成本和要求，還可得到高純度的硫酸皮膚素，有望將硫酸皮膚素應用到更廣的領域中。

2010-11-15 *通訊聯系人

郭睿(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:天然產物深加工。