五味子多糖脫蛋白工藝的研究

汪艷群，孟憲軍，李冬男，孫希云，李 斌

(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110161)

五味子多糖脫蛋白工藝的研究

汪艷群，孟憲軍*，李冬男，孫希云，李 斌

(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110161)

為建立五味子多糖脫蛋白工藝，對三氯乙酸-正丁醇法、Sevag法、酶法+三氯乙酸-正丁醇、酶法+Sevag處理脫除蛋白進行了研究，并測定處理后多糖液中蛋白質含量。結果表明:酶法+三氯乙酸-正丁醇脫蛋白效果最好，即蛋白酶用量為1%、處理溫度為50℃、處理時間為140min、pH為5，酶處理后再用等體積的三氯乙酸-正丁醇溶液重復處理4次，蛋白質含量低于0.005mg/mL。

五味子，多糖，脫蛋白

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子粗多糖 實驗室自制，減壓干燥備用;無水乙醇、葡萄糖、乙醚、苯酚、濃硫酸、牛血清白蛋白、考馬斯亮蘭G-250、三氯乙酸、正丁醇、氯仿、木瓜蛋白酶 均為分析純。

7200型可見分光光度計 尤尼柯(上海)有限公司;電熱恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司; RE-52型旋轉蒸發儀 上海博通經貿有限公司; SHZ-IIIB型循環水真空泵 上海華琦科學儀器有限公司;TDL-5000B型離心機 上海安亭科學儀器廠; DZF6050真空干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 蛋白質含量的測定

以牛血清蛋白為標準物，用考馬斯亮藍G-50染色法制備蛋白質標準曲線［4-6］。

1.3 多糖含量的測定

用葡萄糖為標準物，使用苯酚-硫酸法［6-9］，在恒溫25℃，在490nm處測定標準物濃度與吸光度的對應關系，制備標準曲線。

1.4 三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白

配制2%濃度粗多糖溶液，使三氯乙酸-正丁醇(V∶V為1∶10)與五味子多糖液等體積混合，振蕩10min，靜置1h，重復7次［7-8］。

1.5 Sevag法脫蛋白

配制2%濃度粗多糖溶液，加入其體積1/3的氯仿-正丁醇(4∶1)溶液，振蕩30min，經離心去除沉淀后，取少量水相測蛋白質含量，然后將水相再加入其體積1/3的氯仿-正丁醇溶液，重復13次［7-8］。

1.6 酶處理條件優化

稱取200mg五味子粗多糖溶于1000mL水中。根據蛋白酶的技術參數，結合實驗要求選取:蛋白酶用量、處理溫度、處理時間、pH四個因素。應用“Minitab”軟件，采用中心復合設計方法［10-11］，對實驗進行設計(因素水平設計見表1)，同時進行局部控制，使其他實驗條件保持一致。

表1 中心組合設計因素水平表

1.7 酶法與三氯乙酸-正丁醇法結合脫蛋白

酶法與三氯乙酸-正丁醇法相結合使用，重復8次。

1.8 酶法與Sevag法結合脫蛋白

酶法與Sevag法相結合使用，重復9次。

2 結果與討論

2.1 蛋白質標準曲線

實驗制備蛋白質標準曲線，得到回歸曲線和直線方程:A1=0.110 C1-0.109(C1:蛋白質溶液濃度)，相關系數r1=0.9972，見圖1。

圖1 蛋白質標準曲線

2.2 葡萄糖標準曲線

實驗制備葡萄糖標準曲線，得到回歸曲線和直線方程，A2=0.164+5.270 C2(C2:葡萄糖溶液濃度)，相關系數r2=0.9985，見圖2。

2.3 三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白

如圖3可知，五味子粗多糖經三氯乙酸-正丁醇脫蛋白處理后，蛋白質含量明顯下降，經過6次處理后蛋白質含量在0.005mg/mL左右。在蛋白質脫除的過程中多糖的含量下降趨勢明顯。

圖2 葡萄糖標準曲線

圖3 三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白曲線

2.4 Sevag法脫蛋白

如圖4可知，五味子粗多糖經Sevag法脫蛋白處理后，蛋白質含量明顯下降，經過9次處理后蛋白質含量達到 0.005mg/mL，在 10次處理后維持在0.004mg/mL左右。同樣在蛋白質脫除的過程中多糖的含量有明顯下降趨勢，且損失量較大。

圖4 Sevag法脫蛋白曲線

2.5 酶處理條件優化

2.5.1 模型的擬合 通過對蛋白酶用量、處理溫度、處理時間、pH進行實驗優化設計(結果見表2)，得到相應的二次方程模型:

其中:Y是響應值，即五味子粗多糖中蛋白質的含量，A、B、C、D分別表示蛋白酶用量、處理溫度、處理時間、pH。

響應面分析中對實驗結果進行擬和的二次模型方差分析見表3。F值為18.71，多元相關系數為R2=94.24%，預測R2=78.20%，調整R2=89.20%，說明模型對實驗實際情況擬合較好;P值＜0.0001 (P值＜0.05視為模型擬合顯著)，表明該模型高度顯著，可用來進行響應值的預測。

表3 中心組合設計二次模型方差分析

表4 二次模型回歸方程系數顯著性檢驗

表2 中心組合設計及結果

二次模型中回歸系數的顯著性檢驗(表4)表明，因素B、D對多糖蛋白的脫除效果的線性效應極顯著，因素A、C對多糖蛋白的脫除效果的線性效應顯著;因素B2對多糖蛋白的脫除效果的曲面效應極顯著，因素A2、C2、D2對多糖蛋白的脫除效果的曲面效應不顯著;因素AD、BC對多糖蛋白的脫除效果的交互效應顯著，因素AB、AC、BD、CD對多糖蛋白的脫除效果的交互效應不顯著。說明3個因素均不同程度地對響應值產生顯著或極顯著的影響，本實驗設計的因素選擇是成功的。

將未達到顯著水平的因素剔除，將其平方和和自由度并入剩余項，進行第二次方差分析，以提高檢驗的精確度(表5)。

第二次方差分析，回歸F值為35.01，多元相關系數為R2=91.42%，預測R2=83.24%，調整R2= 88.81%，說明模型對實驗實際情況擬合較好;P值＜0.0001，表明該模型高度顯著，可用來進行響應值的預測。根據模型失擬性分析，說明所建立的三元二次回歸方程在整個回歸空間內的擬合度較好，可用于優化條件的模擬估算。

由表6分析表明，模型回歸及保留的各項因素項均達到顯著水平，說明蛋白質含量與實驗因素之間存在極顯著的回歸關系，其優化的回歸方程為:

其中:Y是響應值，即五味子粗多糖中蛋白質的含量，A、B、C、D分別表示蛋白酶用量、處理溫度、處理時間、pH。

2.5.2 響應值優化與曲面圖分析 由“Minitab”軟件得到優化條件的處理，確定最優酶法脫蛋白工藝為:蛋白酶用量為1%、處理溫度為49℃、處理時間為141min、pH為 5，理論計算蛋白質含量為達到0.07mg/mL。根據實際實驗情況，把優化的工藝條件調整為蛋白酶用量為1%、處理溫度為50℃、處理時間為140min、pH為5，在此條件下進行了驗證實驗，實測蛋白質含量為0.068±0.007mg/mL，與預測值較接近，證明了響應面實驗設計與分析方法在酶法脫除五味子粗多糖蛋白實驗中的應用具有準確性和可靠性。

表5 第二次方差分析

表6 第二次回歸方程系數顯著性檢驗

如圖5可以看出，處理溫度對其他三個因素有明顯的影響，當處理溫度在中間水平條件下，經過處理后的多糖蛋白質含量都較低;在pH與蛋白酶用量的曲面圖中，曲面略微形成了馬鞍型，在pH處于低水平時，隨著酶用量的增加，蛋白質含量明顯升高，但在pH處于高水平時，隨著酶用量的增加，蛋白質含量略微下降，說明pH對蛋白酶活性產生了一定的影響，同時pH在5～6之間也有助于蛋白質變性，當兩者都處于低水平條件下，處理后的多糖蛋白質含量較低;處理時間可能對蛋白酶的活性產生了負面影響，隨著時間的減少，多糖中蛋白質含量也隨之降低;蛋白酶用量的變化并沒有對實驗結果產生較大影響。產生這種現象可能是由于實驗使用的蛋白酶的相關技術參數所至。只有在溫度適中，pH處于酸性，處理時間相對較短的情況下，蛋白酶才能對蛋白質形成較大作用。

圖5 響應面分析圖

2.6 四種脫蛋白方法的比較

從圖6中可以看出，四種方法都對五味子粗多糖有很好的脫蛋白效果，但是在脫除蛋白的過程中同樣對多糖也造成了損失。從脫蛋白的效果來看，兩種方法與酶法相結合處理要好于兩種方法單獨處理，這是由于蛋白酶除了酶解多糖溶液中的游離蛋白質外，還對與多糖結合的蛋白質產生了酶解作用，形成了更多的游離蛋白質，為進一步脫除提供了條件。同樣從對多糖的損失方面來看，相結合的方法也優于這兩種方法的單獨使用，能夠有效地減少多糖的損失。

圖6 四種不同方法的脫蛋白曲線

酶法+三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白與酶法+ Sevag法脫蛋白對蛋白的脫除效果都較好，兩種方法在經過4次處理后，多糖溶液中蛋白質含量都達到了0.005mg/mL以下，酶法+三氯乙酸-正丁醇法略低于酶法+Sevag法，且繼續處理蛋白質含量基本維持不變;兩者多糖含量都維持在20mg/mL以上，酶法+三氯乙酸-正丁醇法要高于酶法+Sevag法。同時通過對經過兩種處理方法后溶液的剩余體積進行比較發現，酶法+三氯乙酸-正丁醇法在經過4次以上處理后，溶液的剩余體積都在45mL以上，而酶法+ Sevag法經4次以上處理后，溶液的剩余體積已經在40mL以下，且隨著處理次數的增多而逐漸減少。綜合以上因素，最終選擇先用酶法對五味子粗多糖溶液進行處理，然后用等體積三氯乙酸-正丁醇溶液對酶法處理完的溶液進行4次脫蛋白處理，完成對粗多糖的脫蛋白過程。

3 結論

本實驗通過對三種不同的方法，單獨或聯合使用對五味子粗多糖脫蛋白效果的研究和比較，在酶法脫蛋白的實驗中通過響應面實驗設計方法，考察了蛋白酶用量、處理溫度、處理時間、pH對脫蛋白效果的影響。實驗分析中，二次方程的模型(總)回歸極顯著，且第二次方差分析后的失擬性檢驗不顯著，說明通過本次實驗所建立的二次回歸方程成功地反映了所考察的四個因素與響應值之間的相關性，實驗設計科學合理。在酶法處理過程中，蛋白酶用量、處理溫度、處理時間、pH都是影響蛋白質含量的關鍵因素，并且處理溫度的曲面效應，蛋白酶用量與pH、處理溫度與處理時間的交互作用都對蛋白質含量有顯著的影響。各因素對蛋白質含量的影響順序為:處理溫度、pH＞處理時間＞蛋白酶用量。酶法處理的最佳工藝條件為:蛋白酶用量為1%、處理溫度為49℃、處理時間為141min、pH為5。根據實際情況，工藝條件調整為:蛋白酶用量為1%、處理溫度為50℃、處理時間為140min、pH為5，在此條件下進行了驗證實驗，實測蛋白質含量為0.068±0.007mg/mL，與預測值0.07mg/mL較接近。

通過對幾種處理方法后溶液中的蛋白質含量、多糖含量以及多次處理后溶液剩余體積等因素進行比較，最終確定先用酶法在工藝參數為:蛋白酶用量為1%、處理溫度為50℃、處理時間為140min、pH為5的條件下對五味子粗多糖溶液進行處理，然后再用等體積三氯乙酸—正丁醇溶液對酶法處理完的溶液進行4次處理，最終多糖溶液中蛋白質含量低于0.005mg/mL。

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Study on removal of protein from polysaccharides of Schisandra chinensis Turcz.Bail.

WANG Yan-qun，MENG Xian-jun*，LI Dong-nan，SUN Xi-yun，LI Bin
(College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China)

To establish the technology of removal of protein from polysaccharides of Schisandra chinensis Turcz. Bail.，the methods of acetocaustin-n-butyl alcohol，chloroform-n-butyl alcohol and both combining enzyme pretreatment respectively were studied and the content of protein was detected after treatment.The results showed that the method of acetocaustin-n-butyl alcohol combining enzyme pretreatment was the best.After enzymic hydrolysis pretreatment of adding 1% protease to the polysaccharide solution in 50℃ at pH5 for 140min，acetocaustin-n-butyl alcohol was added with the same volume of polysaccharide solution to get rid of protein. Treatment of acetocaustin-n-butyl alcohol was repeated four times and the content of protein come down to 0.005mg/mL.

Schisandra chinensis Turcz.Bail.;polysaccharides;removal of protein

TS201.2+3

B

1002-0306(2011)03-0280-05

五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)又名五梅子、玄及、會及、山花椒等，木蘭科多年生落葉藤本。五味子可食用也可藥用，其應用已有2000多年的歷史，常作為方劑用于治療和預防各種疾病，可用于生產藥品、保健品、化妝美容品和多種飲品、食品添加劑等。20世紀90年代以來，許多學者從五味子水提液中分離得到了多糖，目前已經發現五味子多糖具有保肝、抗疲勞、提高白細胞數量、增強免疫系統功能、清除氧自由基、抗衰老、鎮靜催眠、抑制腫瘤、抗突變、鎮痛、降血糖、降血脂等生理活性［1-4］。通常情況下，在多糖提取液中，蛋白質占了很大比例。所以，脫除多糖中的蛋白質已經成為多糖精制過程中非常重要的一步。同時，如何盡量脫除蛋白質并且保留多糖的有效成分也成為了一個很有意義的研究課題［5］。因此，研究五味子多糖脫蛋白工藝，對擴大其應用和工業化生產具有現實意義。為了進一步開發利用這一植物資源，本文通過四種不同的方法，單獨或聯合對五味子粗多糖進行脫蛋白處理，并對其脫蛋白效果和對多糖含量的影響進行研究和比較，得到五味子粗多糖脫蛋白的最佳工藝。

2010-02-22 *通訊聯系人

汪艷群(1980-)，女，博士在讀，講師，研究方向:天然活性成分。