響應面法玉米蛋白肽鋅制備條件的優化

唐軍虎，康瑋麗，任志艷，敬思群

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊830046)

響應面法玉米蛋白肽鋅制備條件的優化

唐軍虎，康瑋麗，任志艷，敬思群*

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊830046)

以玉米蛋白粉為原料，堿性蛋白酶酶解制得玉米肽，與硫酸鋅螯合后，得到玉米蛋白肽鋅。根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，運用Minitab15.0數據統計分析軟件，采用三因素三水平的響應面分析法優化制備玉米蛋白肽鋅的工藝。結果表明:最佳的制備條件為反應時間90min、pH為5、溫度63℃、蛋白肽與鋅的摩爾比為2∶1，在此條件下，螯合率為57.9%。

玉米蛋白肽鋅，制備，響應面分析法，優化

玉米蛋白粉 由新疆天達生物有限公司提供;玉米醇溶性蛋白 實驗室自制;堿性蛋白酶 北京諾維信公司;化學試劑 均為分析純。

微型高速萬能試樣粉碎機，數顯鼓風干燥箱，水浴鍋，酸度計，離心機，電子天平，凱氏定氮儀，冷凍干燥機等。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的酶解 玉米醇溶蛋白→90℃熱變性處理→冷卻至50℃→調pH至9.0→加入堿性蛋白酶→酶解5h→滅酶(90℃/20min)→離心(5000r/min)→玉米蛋白酶解液

1.2.2 玉米蛋白肽鋅的制備

1.2.2.1 玉米蛋白肽鋅的工藝流程 玉米蛋白酶解液→測水解度→加入ZnSO4→攪拌→調節溫度→調節pH→螯合→濃縮→冷凍干燥→玉米蛋白肽鋅

1.2.2.2 玉米蛋白肽鋅制備的單因素實驗 以玉米蛋白肽鋅的螯合率作為指標，分別考察pH、溫度、反應時間、蛋白肽與鋅的摩爾比四個因素對玉米蛋白肽鋅制備的影響，每個因素設定5個梯度，進行單因素實驗。

1.2.2.3 玉米蛋白肽鋅制備條件的優化 本實驗根據Box-Behnken的中心組合設計原理，以pH、溫度、蛋白肽與鋅的摩爾比三個因子為自變量(分別以X1，X2，X3表示)，以螯合率(%，以A表示)為響應值設計了三因素三水平共15個實驗點的響應面分析實驗，15個實驗點分為12個析因點和3個零點，實驗因素水平如表1。

表1 實驗因素水平表

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 玉米蛋白肽鋅的定性分析 采用硫化鈉法。

1.2.3.2 過氧化值(POV)的測定 采用 GB/ T5009.37-2003測定樣品中的POV值。

1.2.3.3 螯合率測定 取10mL螯合液，按1∶8的體積比加入80mL的無水乙醇，經充分攪拌后離心，用EDTA滴定上層的醇層［5］。

螯合率(%)=(金屬離子總量-游離離子含量)/金屬離子總量×100%=C(V2-V1)/CV2× 100%=(V2-V1)/V2×100%

其中:C-EDTA的摩爾濃度;V1-滴定未螯合金屬離子所用EDTA的體積;V2-滴定總加入金屬離子所用EDTA的體積;

1.2.3.4 鋅含量的測定 采用EDTA滴定法。

2 結果與分析

2.1 玉米蛋白肽鋅制備條件的優化

2.1.1 pH對玉米蛋白肽鋅螯合率的影響 pH條件是影響多肽螯合微量元素形成螯合物的重要因素。在pH較低的酸性條件下，H+將與鋅離子競爭供電子基團，不利于多肽微量元素螯合物的生成:在pH較高的條件下，羥基與供電子基團爭奪了鋅離子而優先生成氫氧化鋅沉淀。

選取pH4.5～6.5，溫度50℃，時間1h，蛋白肽與鋅鹽的摩爾比2∶1的條件下，探討pH對螯合反應的影響，結果如圖1所示。

圖1 pH對玉米蛋白肽鋅螯合率的影響

由圖1可知，pH偏高或偏低都會對螯合率產生較大的影響，在pH為5.5左右時，螯合率最高，因此，采用pH5.0、5.5、6.0進行后續的響應面分析實驗。

2.1.2 蛋白肽與鋅的摩爾比對玉米蛋白肽鋅螯合率的影響 在溫度50℃，時間1h和pH 5.0時，探討蛋白肽與鋅的摩爾比對螯合反應的影響，蛋白肽的摩爾數取蛋白肽水解液中的游離氨基的摩爾數，結果見圖2。

由圖2可知，蛋白肽與鋅的摩爾比對螯合反應的影響很大，當比值過大時，蛋白肽鋅的螯合率較小，且造成原料浪費;過小，則不利于螯合反應的進行。當比值為2∶1時，螯合率最大。因此實驗中選取摩爾比值為1∶1、2∶1、3∶1進行后續的響應面分析實驗。

圖2 蛋白肽與鋅的摩爾比對玉米蛋白肽鋅螯合率的影響

2.1.3 反應時間對玉米蛋白肽鋅螯合率的影響 選取溫度50℃，pH 5.5，蛋白肽與鋅的摩爾比為2∶1進行反應時間對螯合反應影響的實驗，結果如圖3所示。

圖3 反應時間對玉米蛋白肽鋅螯合率的影響

從圖3可以看出，在螯合反應的前60min，螯合率雖有增加，但是增長不大，當反應進行到90min以后，螯合率變化趨于穩定，因此，在后續的實驗中，選擇90min作為反應條件，并且不將反應時間作為響應面分析法的考察因素。

2.1.4 溫度對玉米蛋白肽鋅螯合率的影響 在時間90min，pH5.5時，蛋白肽與鋅的摩爾比為2∶1的條件下，進行溫度對螯合反應影響實驗，結果見圖4。

圖4 溫度對玉米蛋白肽鋅螯合率的影響

由圖4可以看出，溫度對螯合反應有顯著的影響。螫合率隨著溫度的增加而升高，當溫度達到60℃后，螯合率變化趨于平緩，因此，在研究中選50、60、70℃進行后續的響應面分析實驗。

2.1.5 響應面法優化玉米蛋白肽鋅的制備條件 實驗以隨機次序進行，以螯合率作為響應值用Minitab15.0程序進行分析，并得出響應面分析圖、回歸擬合方程以及方差分析表。響應面實驗設計與結果見表2。

利用Minitab15.0軟件對實驗數據進行分析，由表3得出擬合二次多項式方程為:

表4 方差分析

表2 三因素三水平中心組合實驗方案及結果

表3 三因素三水平中心組合參數估計

由表3可知，對方程影響顯著程度由大到小依次為摩爾比、溫度、pH，溫度和摩爾比對方程影響最顯著，說明這二者直接關系螯合率的大小，而pH的影響在一定范圍內并不是很顯著，并且得知方程大多數一次項、二次項、交互項的影響都是顯著的，各因素之間不是簡單的線性關系，而是二次關系。

由表4可知，模型的回歸顯著，交互作用較好;失擬項F值很小，表明該方程對實驗擬合情況好，實驗誤差小。因此可以用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。

同時做出中心組合設計實驗所得的三組響應面曲面圖(圖5～圖7)。響應面圖形是特定的響應值Y對應的因素X1、X2、X3構成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素的交互作用以及對響應值的影響。圖中可看到擬合曲面有最大值，對擬合方程求偏導，可得出模型最大值，即為最優的實驗方案。

圖5 pH和摩爾比對螯合率影響的響應面分析

圖6 pH和溫度對螯合率影響的響應面分析

圖7 溫度和摩爾比對螯合率影響的響應面分析

為了進一步確證最佳點的值，利用上述分析進行最優工藝的推導，對回歸方程取一階偏導數為零并整理得:

聯立上述三個方程求解，得到 X1=-0.1390，X2=0.2829，X3=0.2161。換算后得到最佳工藝條件是pH為5.4、溫度62.83℃、摩爾比為2.2∶1?？傻抿下实念A測值為58.3%。

為了驗證響應面法所得結果的可靠性，采用上述優化條件再重復實驗3次，考慮到實際操作的便利，將工藝參數修正為:pH為5、溫度63℃、摩爾比為2∶1。在此條件下玉米蛋白肽鋅的螯合率達到57.9%，相對誤差為0.6%，證明了方程可靠性與響應面分析法的有效性。

2.2 硫化鈉法鑒定分析的結果

氨基酸螯合物是氨基酸基團中的C和N原子與金屬離子配位，形成環狀的螯合分子結構。金屬硫化物的穩定常數遠大于螯合物的穩定常數，當加入硫化鈉時，S2-與穩定螯合物中的金屬離子反應，生成了更穩定的金屬硫化物沉淀，從而使螯合物中的氨基酸或肽游離出來，與茚三酮發生顯色反應，可以利用這一性質來對樣品進行定性鑒定［6-7］。

把不加硫化鈉的樣液加熱至沸騰，用茚三酮試劑檢測，溶液顏色沒有發生改變;加入過量的硫化鈉用玻璃棒攪勻靜置一段時間后，溶液中有白色沉淀生成;過濾后濾液用茚三酮試劑檢測，濾液變為藍紫色。即原待測物質的溶液中沒有游離的蛋白肽，在生成金屬無機鹽沉淀后，又有了游離的蛋白肽。這說明待測物質是蛋白肽和金屬形成的一種特殊物質，它不像蛋白肽金屬鹽那樣在水中以離子狀態存在，也不像無機沉淀那樣不溶于水，即其穩定性大于可溶性無機鹽，而小于無機沉淀。初步判斷該物質為玉米蛋白肽鋅螯合物。

3 結論

硫化鈉法鑒定分析結果表明，本研究所制備螯合物是玉米蛋白肽鋅。

本實驗根據Box-Behnken的中心組合設計原理，以pH、溫度、蛋白肽與鋅的摩爾比三個因子為自變量，采用響應面分析法，得到回歸方程，研究這3個因子的主效應和交互效應對產品質量的影響，以得到提高產品質量的最佳參數，使原料得到充分的利用。玉米蛋白肽鋅的最佳制備工藝為:pH為5、溫度63℃、摩爾比為2∶1，反應時間為90min，在此條件下螯合率可以達到57.9%。

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［5］張紅浸，陳國松，儀明君，等.復合氨基酸銅螯合物的研究［J］.氨基酸和生物資源，2002，24(2):37-40.

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［7］張亞麗，徐忠.酶法復合氨基酸鈣絡合物制備及應用研究［J］.食品科技，2000(6):8-12.

Optimization of the preparation of corn-peptide-zinc

TANG Jun-hu，KANG Wei-li，REN Zhi-yan，JING Si-qun*
(College of Life Sciences＆Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

Corn peptide was obtained via alkali protein enzyme enzymolysis with corn gluten meal as raw material，and then chelated with ZnSO4and corn-peptide-zinc(CPZ)was produced.The preparation process of CPZ was optimized according to Box-Behnken central composition design principle.The method of response surface analysis with 3 factors and 3 levels combined with Minitab15.0-statistical data analysis software was adopted. According to the above results，the optimum preparation conditions were obtained as follows:reaction time 90min，pH5，temperature 63℃，mol ratio 2∶1.Under these conditions，the chelating rate was up to 57.9%.

corn-peptide-zinc;preparation;response surface methodology(RSM);optimization

TS255.1

B

1002-0306(2011)03-0294-04

玉米蛋白粉(Corn gluten meal，CGM)是玉米淀粉生產味精的副產品。據官方統計，新疆玉米種植面積約800萬畝，產地分布南北疆各地，年產量可達360～400萬t。新疆天達生物工程有限公司以玉米為原料，現年產味精3.6萬t，同時產生蛋白粉4200t，經本實驗室測定玉米蛋白粉中蛋白質含量高達61.5%，是制備玉米短肽、氨基酸的良好原料，具有極大的開發價值［1-2］。近年來，出現了有關于植物蛋白為原料，生產具有穩定性好、吸收率高、生物效價高、毒性小等優點的小肽螯合鹽的報道［3-4］，但玉米蛋白肽鋅的研究尚未見報道。在玉米蛋白肽鋅的制備過程中，螯合條件的確定是至關重要的。傳統的正交實驗雖然能夠同時考慮幾種因素，并確定最佳組合，卻不能找出因素和響應值之間的函數關系，即回歸模型，從而無法找到全部水解因素的最佳組合和響應值的最優值。本研究通過Minitab15.0軟件，采用響應曲面法優化酶解玉米蛋白制備玉米蛋白肽鋅的工藝，通過建立數學模型，以期獲得最優的生產工藝參數，獲得最佳制備工藝，為玉米蛋白肽鋅的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2010-03-26 *通訊聯系人

唐軍虎(1984-)，男，碩士研究生，研究方向:食品科學。

新疆維吾爾自治區科技科技支疆項目資助(200991236)。