常用防腐劑對西式火腿腸主要腐敗菌抑菌作用的研究

陳南南，徐 歆，閻永貞，李衛芬，*，黃 琴，陳有亮，周緒霞

(1.浙江大學動物科學學院飼料科學研究所教育部動物分子營養學重點實驗室，浙江杭州310029; 2.浙江大學動物科學學院動物產品加工實驗室，浙江杭州310029)

常用防腐劑對西式火腿腸主要腐敗菌抑菌作用的研究

陳南南1，徐 歆1，閻永貞1，李衛芬1，*，黃 琴1，陳有亮2，周緒霞1

(1.浙江大學動物科學學院飼料科學研究所教育部動物分子營養學重點實驗室，浙江杭州310029; 2.浙江大學動物科學學院動物產品加工實驗室，浙江杭州310029)

目的:測定常用食品防腐劑對西式火腿主要腐敗菌的抑制作用。方法:采用微量稀釋法測定不同防腐劑對木糖葡萄球菌、地衣芽孢桿菌和雷氏普羅威登菌的最小抑菌濃度(MIC)。結果:對于木糖葡萄球菌(G+)，抑菌效果最好的是Nisin和ε-聚賴氨酸，MIC均為12.5μg/mL;對于地衣芽孢桿菌(G+)，抑菌效果最好的是D-異抗壞血酸鈉、丙酸鈣、檸檬酸和檸檬醛，MIC均為12.5μg/mL;對于雷氏普羅威登菌(G-)，抑菌效果最好的是過氧化氫和檸檬酸，MIC均為25μg/mL。結論:不同防腐劑對西式火腿腸主要腐敗菌的抑制效果有所差異，應復配使用。

防腐劑，西式火腿腸，腐敗菌，最小抑菌濃度(MIC)，抑菌作用

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗所用菌株 均為本實驗室從腐敗變質的西式火腿腸中分離純化所得，實驗菌株及其培養基見表1;檸檬酸、檸檬醛、脫氫醋酸鈉、山梨酸鉀、紅曲色素、D-異抗壞血酸鈉、尼泊金復合酯鈉、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、雙乙酸鈉、蘋果酸 杭州大好家添加劑有限公司，食品級;乳酸鈉、30%過氧化氫、丙酸鈣 浙江大學設備科，分析純;乳酸鏈球菌素(Nisin) 浙江銀象生物工程有限公司惠贈，食品級;硫酸魚精蛋白 上?？笊锛夹g有限公司，分析純;溶菌酶 杭州中香化學有限公司，食品級;那西肽 杭州匯能生物技術有限公司，分析純;殼聚糖 杭州華東醫藥股份有限公司，分析純;納它霉素、ε-聚賴氨酸 北京東方瑞德公司，分析純。

AB204-N普及型分析天平、320 pH計 瑞士Mettler Toledo公司;722型分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;超聲波破碎儀 美國Sonic公司;電子數顯恒溫培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;Multiscan MK3酶標儀 芬蘭Thermo公司。

表1 微生物培養基及培養條件

1.2 實驗方法

1.2.1 防腐劑母液的配制及其倍比稀釋 乳酸鈉、雙乙酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈣、檸檬酸、檸檬醛、蘋果酸、D-異抗壞血酸鈉、脫氫醋酸鈉和ε-聚賴氨酸溶液:稱取1.28g試劑，無菌水溶解，定容至100mL，搖勻，4℃備用。

過氧化氫溶液:量取30%過氧化氫4.27mL，無菌水稀釋，定容至100mL，搖勻，4℃備用。

對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯和尼泊金復合酯鈉溶液:稱取1.28g試劑，無水乙醇溶解，定容至100mL，搖勻，4℃備用。

Nisin、硫酸魚精蛋白、溶菌酶和那西肽溶液:稱取1.28g試劑，冰醋酸溶解，定容至100mL，搖勻，4℃備用。

殼聚糖溶液:稱取1.28g殼聚糖，稀鹽酸溶解，定容至100mL，搖勻，4℃備用。

倍比稀釋:取11支EP管，每管加入0.5mL無菌水，在第1管加入0.5mL母液，混勻，吸取0.5mL混合液至第2管，混勻，再吸取0.5mL混合液至第3管，如此反復操作直至第11管，濃度依次為6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL。

1.2.2 菌液制備 本實驗采用細菌生長法。將三種腐敗菌置于各自的選擇性培養基上進行培養24h，用接種環挑取典型形態的供試菌落，接種于5mL LB液體培養基中，37℃，200r/min，培養2～6h至對數生長期。取適量菌液，用LB液體培養基調整濃度至105cfu/mL。

1.2.3 MIC測定 無菌條件下，依次將不同防腐劑的各倍比稀釋溶液按稀釋度從低到高加入到無菌96孔板的第1列至第11列，每孔50μL，每個稀釋度3個重復，第12列為陽性對照，加等量無菌水。隨后每孔再加入50μL菌液，密封混勻。此時，第1列至第11列防腐劑終濃度分別為3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL。用酶標儀測定0h的OD630值，然后將96孔板置于30℃培養箱中培養24h，再次測定OD630值。通過對比0h與24h時菌液的OD630值，確定不同防腐劑對各主要腐敗菌的MIC，以此衡量抑菌效果。

2 結果與分析

各種常用食品防腐劑對西式火腿腸的主要腐敗菌的抑制作用見表2。

表2 不同防腐劑對西式火腿腸主要腐敗菌的MIC

由表2可見，在本抑菌實驗中所用的20種防腐劑中，大部分防腐劑僅對一種或二種受試菌抑制效果較好，而對三種受試菌均具有良好抑菌效果(MIC≤200μg/mL)的只有4種，檸檬酸、檸檬醛、脫氫醋酸鈉和ε-聚賴氨酸。對于木糖葡萄球菌(G+)，抑菌效果最好的是Nisin和ε-聚賴氨酸，MIC為12.5μg/mL;其次是硫酸魚精蛋白、溶菌酶和那西肽，MIC均為25μg/mL;再次是檸檬醛和脫氫醋酸鈉，MIC均為50μg/mL;較差的有乳酸鈉和山梨酸鉀，MIC均為1600μg/mL;最差的是丙酸鈣、對羥基苯甲酸甲酯，MIC均為3200μg/mL。對于地衣芽孢桿菌(G+)，抑菌效果最好的是丙酸鈣、檸檬酸、檸檬醛和D-異抗壞血酸鈉，MIC均為12.5μg/mL;其次是山梨酸鉀和脫氫醋酸鈉，MIC均為25μg/mL;再次是雙乙酸鈉、硫酸魚精蛋白、ε-聚賴氨酸和那西肽，MIC均為50μg/mL;較差的是殼聚糖，MIC均為3200μg/mL;最差的是過氧化氫，其在本次實驗的濃度范圍內未能表現出抑菌作用。對于雷氏普羅威登菌(G-)，抑菌效果最好的是過氧化氫和檸檬酸，MIC均為25μg/mL;其次是檸檬醛，MIC為50μg/mL;再次是ε-聚賴氨酸，MIC為100μg/mL;較差的是那西肽，MIC分別為3200μg/mL;最差的是Nisin、D-異抗壞血酸鈉和溶菌酶，它們在本次實驗的濃度范圍內未能表現出抑菌作用。

3 討論

3.1 Nisin

Nisin對許多G+菌，包括葡萄球菌、李斯特氏菌、鏈球菌、微球菌、分枝桿菌、棒桿菌和乳桿菌等，具有明顯的抗菌活性;一些產孢子的G+菌，如芽孢桿菌、梭菌對Nisin尤其敏感，而它們的孢子比營養細胞更敏感;但Nisin對G-菌、酵母菌和霉菌沒有作用［2］。張百剛等［3］對Nisin的抑菌作用進行研究后發現，在相同的處理條件下，Nisin對枯草芽孢桿菌(G+)的抑菌效果最好，對金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌效果也較好，但是對大腸桿菌(G-)的抑茵效果最差。本實驗中，Nisin對木糖葡萄球菌(G+)與地衣芽孢桿菌(G+)均表現出了很好的抑菌效果，而對雷氏普羅威登菌(G-)無抑菌作用。雖然本實驗與前一實驗所用菌種有所不同，但再一次證明了Nisin對G+菌具有優異的抑菌活性，但也存在對G-菌抑菌活性差的缺點。因此，在設計復配防腐劑配方時，可將Nisin與對G-菌具有良好抑菌活性的防腐劑進行組合。

3.2 山梨酸鉀

在本實驗中，山梨酸鉀對地衣芽孢桿菌(G+)具有很強的抑菌活性，對雷氏普羅威登菌(G-)的抑菌活性一般，而對木糖葡萄球菌(G+)抑菌活性較差，這與前人的研究成果相符。裴家偉等［4］研究了山梨酸鉀對5株羊肉腐敗菌株的抑菌效果，結果表明，0.25‰以上山梨酸鉀能夠有效抑制105cfu/mL G+短芽孢桿菌的生長，但對G+球菌、G-螺旋菌和腸桿菌效果不明顯?？梢?，山梨酸鉀的抑菌作用具有一定的針對性和局限性，不宜單獨用于肉與肉制品的防腐保鮮［5-6］。

3.3 檸檬酸和檸檬醛

本實驗結果表明檸檬酸和檸檬醛具有廣譜的抑菌作用，這與他人的報道較一致。石玉新發現檸檬酸對嗜水氣單胞菌(G-)、副溶血弧菌(G-)和熒光假單胞菌(G-)的MIC分別為1100、800、1250μg/mL［7］。檸檬醛屬于開鏈單萜，具有檸檬醛a(香葉醛)和檸檬醛b(橙花醛)兩種順反異構體，其對金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G-)、傷寒桿菌(G-)和痢疾桿菌(G-)有較高的抑菌活性［8］。林翠梧等報道毛葉木姜子葉油(含有檸檬醛)在1000μg/mL的情況下，可以完全抑制枯草桿菌(G+)、白葡萄球菌(G+)和四鏈球菌(G+)的繁殖，對大腸桿菌(G-)也有一定的抑制作用［9］。

3.4 硫酸魚精蛋白

硫酸魚精蛋白，又稱精蛋白、魚精蛋白、魚精蛋白硫酸鹽，是從成熟雄魚的精囊組織中提取的一種低分子量強堿性蛋白，對G+菌、酵母菌、霉菌均有良好的抑菌活性，但對G-菌的抑制作用較差。王南舟等［10］研究發現魚精蛋白對食品常見污染菌的生長有很強的抑制效果，MIC均在1000μg/mL以下，對G+菌效果更好。王陸玲等［11］的結果顯示，魚精蛋白對供試G+菌有很好的抑制作用，其MIC均小于100μg/mL，但對供試革蘭氏陰性菌作用較弱，其 MIC均大于1500μg/mL，這與本實驗結果相似。

3.5 脫氫醋酸鈉和雙乙酸鈉

本實驗中，脫氫醋酸鈉對木糖葡萄球菌(G+)、地衣芽孢桿菌(G+)與雷氏普羅威登菌(G-)的MIC分別為50、25和200μg/mL，表明其是一種高效、廣譜抑菌的食品防腐劑，這與黎婉園等的研究結果一致［12］。而肖紅等［13］的研究表明，雙乙酸鈉需要較高濃度(25g/L)才對細菌有抑制作用，這可能與所用菌種及菌液初始濃度不同有關。

3.6 ε-聚賴氨酸

本實驗中，ε-聚賴氨酸對三種西式火腿腸主要腐敗菌的MIC均低于100μg/mL，表現出高效廣譜的抑菌活性，這與前人的研究結果相符。秦蕓樺等［13］的研究表明，ε-聚賴氨酸的抑菌譜很廣，除枯草桿菌和蠟狀芽孢桿菌對其的耐受性比較好外，其它細菌對其的敏感性均比較強，MIC都不高于25mg/L。李誠等［14］研究表明，ε-聚賴氨酸對大腸桿菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)和保加利亞乳桿菌(G+)的MIC均為12.5mg/L，對枯草芽孢桿菌(G+)為25mg/L。值得注意的是，ε-聚賴氨酸作為新型的天然防腐劑，還具有水溶性好、安全性高、熱穩定性好、抑菌pH范圍廣等優點［15］。

3.7 那西肽

那西肽屬于含硫多肽類抗生素，由一種從阿根廷土壤中分離出的放射菌培養生成，對細菌等病原微生物有抑制、殺滅作用。周善湘等［15］比較了國產和進口那西肽的抑菌活性，發現兩者抑菌效果一致，對葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、鏈球菌屬及四聯球菌屬的14株革蘭氏陽性菌均有明顯的抑制作用，各菌的MIC均不高于1μg/mL，部分僅為0.001μg/mL;而對腸桿菌科、假單胞菌屬及不動桿菌屬等革蘭氏陰性菌的抑制作用不理想，各菌的MIC＞125μg/mL。本實驗中，那西肽對木糖葡萄球菌(G+)與地衣芽孢桿菌(G+)均表現出了較強的抑制作用，而對雷氏普羅威登菌(G-)的抑制作用很弱，這與前人的研究結果一致。綜上所述，那西肽僅能有效抑制G+菌，因此適合與抗G-菌的防腐劑配合使用。

3.8 主要腐敗菌對不同防腐劑的敏感性

G+菌和G-菌的結構差異表現在細胞壁上。G+菌細胞壁較厚，肽聚糖含量豐富，但組成簡單，通透性較高;而G-菌細胞壁較薄，肽聚糖含量少，但組成復雜，包含磷脂、蛋白質和脂多糖(LPS)等成分，結構致密，僅允許分子量小于600的分子通過。由于細胞壁結構存在上述顯著不同，導致這兩類細菌在染色性、抗原性、毒性和藥物敏感性等方面都存在很大的差異［17］。本實驗中，不同防腐劑對主要腐敗菌的MIC直接反映了主要腐敗菌對不同防腐劑的敏感性。從實驗結果不難發現，受試G+菌與G-菌對大部分防腐劑的敏感性確實存在一定的差異?？梢?，受試菌的細胞壁結構直接影響了防腐劑的抑菌效果。

雖然木糖葡萄球菌和地衣芽孢桿菌同屬于G+菌，但兩者對本實驗所用防腐劑的敏感性也不盡相同。木糖葡萄球菌對Nisin、尼泊金復合酯鈉、過氧化氫、硫酸魚精蛋白、ε-聚賴氨酸、溶菌酶、那西肽和殼聚糖的敏感性高于地衣芽孢桿菌。在上述防腐劑中，僅尼泊金復合酯鈉和過氧化氫是分子量小于200的化學防腐劑，其他皆為天然防腐劑，且分子量均在1000以上。而地衣芽孢桿菌對雙乙酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈣、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、檸檬酸、檸檬醛、D-異抗壞血酸鈉和脫氫醋酸鈉較為敏感，這些防腐劑大多為分子量不超過220的化學防腐劑?？梢?，木糖葡萄球菌對分子量較高的天然防腐劑較為敏感，而地衣芽孢桿菌對分子量較低的化學防腐劑較為敏感，這可能與G+球菌和桿菌的細胞形態、結構及組成不同有關。

本實驗中，對雷氏普羅威登菌具有良好抑菌效果(MIC≤200μg/mL)的防腐劑有對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、過氧化氫、檸檬酸、檸檬醛和ε-聚賴氨酸6種，其中僅ε-聚賴氨酸為天然防腐劑，其他皆為化學防腐劑。而前文提及僅分子量小于600的分子能通過G-菌的細胞壁。因此推斷，雷氏普羅威登菌對上述化學防腐劑敏感可能是由于它們的分子能穿透細胞壁而作用于細菌胞體。至于ε-聚賴氨酸，可能是以某種特殊的方式穿透雷氏普羅威登菌的細胞壁，其主要抑菌機理是抑制細菌的呼吸作用，同時作用于細胞膜和蛋白合成系統，與核糖體結合抑制蛋白和酶的合成，從而達到殺菌目的［15，18］。

4 結論

本實驗測定了19種常用食品防腐劑對3種西式火腿主要腐敗菌的MIC。對于木糖葡萄球菌(G+)，抑菌效果最好的是Nisin和ε-聚賴氨酸，MIC均為12.5μg/mL;對于地衣芽孢桿菌(G+)，抑菌效果最好的是D-異抗壞血酸鈉、丙酸鈣、檸檬酸和檸檬醛，MIC均為12.5μg/mL;對于雷氏普羅威登菌(G-)，抑菌效果最好的是過氧化氫和檸檬酸，MIC均為25μg/mL。同時，不同防腐劑對西式火腿腸主要腐敗菌的抑制效果有所差異，應復配使用。以上實驗結果可為后續的西式火腿腸安全復配型防腐劑的研制提供實驗依據。

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Study on bacteriostasis of common preservatives for major spoilage bacteria in western-style ham-sausages

CHEN Nan-nan1，XU Xin1，YAN Yong-zhen1，LI Wei-fen1，*，HUANG Qin1，CHEN You-liang2，ZHOU Xu-xia1
(1.Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition Ministry of Education，Institute of Feed Science，College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China; 2.Laboratory of Animal Product Processing，College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

Objective:The bacteriostasis of common preservatives for major spoilage bacteria in western-style hamsausages was studied.Methods:The minimal inhibition concentration(MIC)of different preservatives for Staphylococcus xylosus，Bacillus licheniformis and Providencia rettgeri was determined by mean of micro-dilution assay.Results:The preservatives with the best inhibitory effect(MIC=12.5μg/mL)to Staphylococcus xylosus(G+cocci)were Nisin and ε-poly-L-lysine.The preservatives with the best inhibitory effect(MIC=12.5μg/mL)to Bacillus licheniformis(G+bacillus)were D-Sodium isoascorbiate，calcium propionate，citric acid and citral.The preservatives with the best inhibitory effect(MIC=25μg/mL)to Providencia rettgeri(G-bacillus)were hydrogen peroxide，citric acid and ε-poly-L-lysine.Conclusion:The bacteriostasis of common preservatives for major spoilage bacteria in western-style ham-sausages was irregular and it’s better to use compound preservatives.

preservative;western-style ham-sausages;spoilage bacteria;minimal inhibition concentration (MIC);bacteriostasis

TS202.3

A

1002-0306(2011)03-0343-04

微生物大量繁殖是引起食品腐敗變質的最主要因素［1］。為了延長食品的保藏期，人們在食品加工過程采用各種手段使微生物喪失活性、延緩或阻止其生長。添加防腐劑是其中一種非常方便、有效的食品防腐方法，因而被普遍采用。食品防腐劑根據其來源和性質分為化學防腐劑和天然防腐劑兩大類。隨著科學技術的發展以及檢測手段的完善，人們逐漸發現一些化學防腐劑存在誘癌性、致畸性和易引起食物中毒等問題。而天然防腐劑具有抗菌性強、安全無毒、水溶性好、熱穩定性好、作用范圍廣等化學防腐劑無法比擬的優點，不但對人體健康無害，而且還具有一定的營養價值。因此開發高效、安全、穩定的天然防腐劑已成為食品科學研究的熱點之一。目前已被國家批準使用的天然防腐劑有乳酸鏈球菌素(Nisin)、溶菌酶、ε-聚賴氨酸、殼聚糖等。本實驗室分析了西式火腿腸主要腐敗菌的菌相。結果發現，西式火腿腸在25℃下保存28d開始變質，主要腐敗菌為:腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、葡萄球菌、弧菌和李斯特菌，分別占細菌總數的33%、14%、12%、9%、3%和0.9%，其中鑒定的腐敗菌有9株，分別為雷氏普羅威登菌、鮑氏不動桿菌、普通變形桿菌、肺炎克雷伯菌、傷口埃希菌、河生腸桿菌、木糖葡萄球菌、淺金黃色單胞菌和地衣芽孢桿菌。并測定了19種常用食品防腐劑對木糖葡萄球菌、地衣芽孢桿菌和雷氏普羅威登菌3種西式火腿主要腐敗菌的最小抑菌濃度(minimal inhibition concentration，MIC)，旨在為西式火腿腸安全復配型防腐劑的研制提供實驗依據。

2010-02-25 *通訊聯系人

陳南南(1982-)，男，碩士研究生，主要從事微生物方面的研究。

浙江省重大科研專項(2006C12066)。