固定化小麥酯酶生物傳感器的制備及應用

王會友，王 濤，王振宇，2，于 偉

(1.東北林業大學林學院食品科學專業，黑龍江哈爾濱150040; 2.哈爾濱工業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150086)

固定化小麥酯酶生物傳感器的制備及應用

王會友1，王 濤1，王振宇1，2，于 偉1

(1.東北林業大學林學院食品科學專業，黑龍江哈爾濱150040; 2.哈爾濱工業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150086)

將固定化酶膜與精密酸度計的玻璃電極連接制備出了生物傳感電極探頭，并對兩種常見的有機磷農藥樂果和敵百蟲進行測試，結果:樂果濃度在1×10-8～1×10-3mol/L內與小麥酯酶的抑制率呈線性關系，回歸方程為y=13.02x +118.7，相關系數為0.995，最低檢出限(LDC)為1.7×10-9mol/L;敵百蟲濃度在1×10-8～1×10-3mol/L內與小麥酯酶的抑制率呈線性關系，回歸方程為y=13.08x+112.7，相關系數為0.997，LDC為1.1×10-8mol/L。以國家標準方法測得結果為對照，進行實際樣品檢測，檢測方程得出的結果回收率為真實值的87.9%～92.3%，而生物敏感膜重復使用20次以內其酶活保存率為初始酶活的90%左右。因此，此傳感器可以應用于現場有機磷農藥的實驗檢測等。

固定化，小麥酯酶，生物傳感器，有機磷農藥

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥(龍麥26號) 黑龍江省農科院育種研究所提供;固定化小麥酯酶酶膜 實驗自制;丙酮 天津市北方天醫化學試劑廠;α-萘酚、乙酸-α-萘酯國藥集團化學試劑有限公司;固藍B、TritonX-100、2-吡啶醛肟甲基碘化物 Sigma;TEOS 北化恒業精細化工有限公司;PVA 天津市科密歐化學試劑開發中心;PEG-400、甘油 天津市光復精細化工研究所。

電子恒溫水浴鍋(DK-98-I) 天津泰斯特儀器有限公司;磁力攪拌器(78-1) 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司;精密型酸度計(pHS-3C) 上海雷磁儀器廠;飽和甘汞電極 上海羅素科技有限公司;氣相色譜儀(GC-2010) 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化小麥酯酶酶膜的制備工藝 小麥→粉碎→過40目篩→鹽溶液提取→離心分離→取上清液→過濾→測定酶活→固定化制備小麥酯酶酶膜

固定化制備方法:將去離子水與一定量的硅酸酯類化合物按照一定比例混合(R值為8.25，V/V)，加入25μL HCl，120mL甘油溶液(75%)和400mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5%)，超聲30min。之后吸取80μL溶膠，加入 150μL 9.84%的 TritonX-100和162μL 5.41%的PEG-400溶液，漩渦振蕩20min即得到溶膠。

將小麥酯酶以30mL/g的比例溶解于pH6.6的磷酸緩沖溶液(PBS)中，磁力攪拌30min。吸取60μL的酶液加入到雜化溶膠中，旋渦振蕩10min。吸取100μL的混合溶膠均勻涂布于載玻片上，于4℃干燥36h，即得到固定化后的小麥酯酶。

1.2.2 小麥酯酶酶活測定方法 酶活的測定根據Asperen［8］等方法改進。

1.2.2.1 α-萘酚標準曲線的繪制 用3mL不同濃度的α-萘酚溶液與0.5mL 0.8%固蘭B鹽3.5%SDS溶液混合均勻，30℃恒溫水浴5min。用蒸餾水作空白，待1min讀數穩定后595nm處讀取OD值。以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標，得標準曲線。

1.2.2.2 小麥酯酶酶活的測定 將酶液按一定比例稀釋，取3mL稀釋后的酶液加入25μL 0.8mmol/L乙酸α-萘酯丙酮溶液，漩渦振蕩均勻，在30℃恒溫水浴5min。之后加入0.5mL 0.8%固蘭B鹽3.5%SDS溶液，漩渦振蕩均勻，于30℃恒溫水浴5min。用不加乙酸-α-萘酯的反應液作空白，待1min讀數穩定后在595nm讀取OD值。根據下式計算酶液的活性:

式中:E:小麥酯酶活性(U/mL);C:酶液的稀釋倍數;k:α-萘酚標準曲線斜率;y:α-萘酚標準曲線的截距;OD:反應液的吸光度;V:反應酶液的體積，mL。

1.2.3 生物傳感電極探頭元件的制備 將1mL的TEOS與7.7mL的去離子水按照一定比例混合，加入25μL HCl，120mL甘油溶液(75%)和400mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5%)，超聲30min。之后吸取80μL溶膠，加入150μL 10.13%的TritonX-100和162μL 5.80%的PEG-400溶液，漩渦振蕩20min即得到雜化溶膠。

將純化后的小麥酯酶以30mL/g的比例溶解于一定pH6.5的磷酸緩沖溶液(PBS)中，磁力攪拌30min。吸取60μL的酶液加入到雜化溶膠中，旋渦振蕩10min。吸取100μL的混合溶膠均勻涂布于載玻片上，于4℃干燥36h，即得到固定化后的小麥酯酶。

使用前，將其在pH6.5的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡10min，再用O型圈將該酶膜固定在球型精密型酸度計玻璃電極表面，即制成生物傳感電極探頭。

1.2.4 生物傳感電極探頭元件的測定 移取5.0mL0.001mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)于電解池中，插入傳感器和參比電極，加入乙酸-α-萘酯，使其濃度達到一定濃度，測量出生物傳感器的初始電位E0，加入適量含有機磷農藥的溶液，溫育一段時間，然后測量最終電位E1，則傳感器的抑制率為:

在小麥酯酶的催化作用下，乙酸-α-萘酯水解為α-萘酚和乙酸，這個過程的發生使生物反應系統的電位發生變化，有機磷農藥能強烈地抑制小麥酯酶的催化作用，所以加入有機磷農藥以后，上述反應進行的程度會有所降低，溶液中有機磷農藥的濃度越高，反應進行的程度就會越慢，電位改變的幅度相應就越?。?-10］。通過建立抑制率和農藥濃度間的關系曲線，可以得出農藥的檢測方程，來確定農藥的濃度［11］。

2 結果與討論

2.1 α-萘酚標準曲線

根據ASPEREN等的方法測得OD值與α-萘酚含量關系，繪制標準曲線如圖1。

圖1 α-萘酚標準曲線

2.2 酶負載量對生物傳感電極探頭電位響應的影響

將冷凍干燥后不同質量的小麥酯酶(1～4g)溶解到30mL的pH6.5的磷酸緩沖溶液(PBS)中，吸取60μL的酶液用溶膠凝膠法固定，測定底物的電位響應［12］。

如圖2所示，當酶膜上固定2g小麥酯酶時，其響應的峰電位達到最大值。但是，當進一步增加酶的負載量時，膜的厚度增加，導致電阻增大，從而該生物傳感器對乙酸-α-萘酯的響應減小。采用含有較低的酶負載量，有利于減小膜中的擴散障礙，實現對低濃度農藥的動力學控制和高靈敏度。所以采用2g小麥酯酶為每張酶膜上最佳的酶的負載量。

圖2 小麥酯酶負載量對不同濃度乙酸-α-萘酯的電位影響

2.3 溶膠凝膠量與小麥酯酶的體積比對生物傳感探頭電位響應的影響

由于溶膠凝膠法可以很好地保持蛋白質表面的微觀結構的整體性和方向一致性，從而對組分的活性和穩定性損傷較小。溶膠凝膠材料的用量和所固定化的小麥酯酶量之比對測定電位有著直接的影響。比值少，則固定不牢靠，會造成測定過程中酶的流失［13］;比值大亦會增大電子轉移過程中的電阻，延長響應時間。

固定小麥酯酶固定化量2g，改變溶膠凝膠材料的用量，制備不同溶膠凝膠材料與小麥酯酶體積比的酶膜，用于測定不同濃度底物的電位響應。由圖3確定了最佳的溶膠凝膠與小麥酯酶體積比為0.4。

圖3 溶膠凝膠體積與酶的體積比對不同濃度乙酸-α-萘酯的穩態電位影響

2.4 緩沖溶液pH對生物傳感探頭電位響應的影響

實驗表明，不同酸度的磷酸鹽緩沖溶液會影響到傳感器的抑制率［14］(圖4)。同樣測定5×10-3mol/L的乙酸-α-萘酯，pH在6.5～7.5的范圍內，響應電位最大，且十分穩定。其中過強的酸堿性對酶都會起到破壞作用，同時由于有機磷農藥在pH＞8時易發生水解，圖中在pH＞8時，響應電位的下降可能與此有關。為了測定時既可以獲得較高的靈敏度又防止有機磷農藥水解，故緩沖溶液的pH選取7.0。

2.5 乙酸-α-萘酯濃度對生物傳感探頭電位響應的影響

圖4 pH對乙酸-α-萘酯響應電位的影響

不同濃度的底物對生物傳感器的響應性能會產生影響［15］(圖5)。實驗表明，底物濃度在0.05～1.6mmol/L范圍內，響應電位值與底物濃度的對數值呈線性關系，可以在此范圍內進行實驗。本實驗選用0.8mmol/L作為底物濃度。

圖5 響應電位與乙酸-α-萘酯濃度的關系圖

2.6 溫育時間對生物傳感器電位響應的影響

兩種有機磷農藥對小麥酯酶的抑制作用隨著時間的變化［16］，如圖6。酶的殘留活性在抑制作用開始的10min里迅速減小，大約10min抑制作用完成95%。所以在農藥的測定過程中，溫育時間選擇為10min。

圖6 小麥酯酶殘留活性隨時間變化趨勢

2.7 有機磷農藥檢測標準曲線的建立

由于有機磷農藥對小麥酯酶有抑制作用［17］，這樣將導致在含有農藥的基液中的電位發生變化，電位的變化量與農藥的濃度在一定范圍內有線性關系。根據公式(1)，將電位變化量換算成有機磷農藥的抑制率I，見表1和表2。再以抑制率I對樂果和敵百蟲兩種常用農藥濃度對數作圖，如圖7。

表1 樂果檢測實驗數據換算表

表2 敵百蟲檢測實驗數據換算表

圖7 樂果和敵百蟲農藥測定標準曲線

結果表明，固定化小麥酯酶對兩種有機磷農藥的抑制率在其濃度為1×10-8～1×10-3mol/L的范圍內成線性關系。線性方程、相關系數R2可求，同時，對小于10-8mol/L濃度農藥繼續進行檢測，得出實際檢測下限。各種參數見表3。

表3 兩種有機磷農藥的檢測參數

從表3可以看出，雖然敵百蟲的抑制曲線相關系數優于樂果，但是小麥酯酶對樂果的檢測下限卻要低于敵百蟲。這可能是由于小麥酯酶對敵百蟲的選擇性要強于樂果，而樂果對小麥酯酶的抑制性要高于敵百蟲的原因。

2.8 有機磷農藥檢測曲線的擬合實驗

配制適宜濃度的樂果和敵百蟲溶液噴灑洗凈的白菜后在封閉環境放置過夜，取出后剪成1cm2左右的碎片浸入丙酮溶液中振蕩30min過濾，將所得的兩種農藥的丙酮提取液定容至25mL，采用得到的檢測標準曲線和國家標準方法進行檢測，結果見表4。

表4 真實樣品中兩種農藥的檢測結果(n=5)

采用本實驗得出的檢測曲線檢測樣品溶液中兩種農藥的濃度，測定5次取平均值，為測定值。再按照國家標準方法利用氣相色譜法對上述兩個樣品溶液進行分析，為加入值，結果顯示白菜中兩種農藥的殘留量加入值分別為樂果濃度為0.182×10-4mol/L，敵百蟲濃度為0.158×10-4mol/L。將用檢測標準曲線得出的結果同國標方法相對照，樂果的檢測結果回收率為真實值的 88.9%～92.3%，標準偏差為3.05%;敵百蟲的檢測結果回收率為真實值的87.9%～91.7%，標準偏差為3.24%，均在5%以下，表明用本文提出的方法分析蔬菜中的有機磷農殘留與標準方法基本一致，結果滿意。

2.9 生物傳感電極探頭的半衰期測定

生物傳感探頭的半衰期取決于電極探頭的使用時限、酶膜的重復次數等因素。但是最重要的是酶膜中固定化小麥酯酶的活性。農藥的抑制作用使酶膜中的小麥酯酶活性降低，導致傳感器的靈敏度下降，檢測數值不穩定，造成誤差。為了恢復小麥酯酶的活性，把傳感器在1%的2-吡啶醛肟甲基碘化物(2-PAM)溶液或在pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中浸泡10min后相比較，結果如圖8。

圖8 使用次數對酶活保存率的影響

由圖8可以看到，經過2-PAM復活處理的酶膜中，使用0～6次時，小麥酯酶的活性始終在95%以上，而用PBS處理過的酶膜3次使用過后就在95%以下，隨后急劇下降。由后續實驗可知，經過2-PAM處理后的酶膜一般可以重復使用10～20次，在0～13次時的酶活保存率可恢復到原來活性的95%以上，14～20次為初始酶活的90%～95%。經浸泡后的電極用緩沖溶液清洗干凈，繼續使用。而當傳感器上的小麥酯酶膜失效，可更換新的小麥酯酶膜，傳感器仍可反復使用。

3 結論

3.1 確定了每張酶溶膠凝膠傳感膜上最佳反應條件為小麥酯酶的負載量2g;溶膠凝膠與小麥酯酶體積比0.4;有機磷農藥檢測時體系中緩沖溶液的pH為7.0、乙酸-α-萘酯濃度為 0.8mmol/L、溫育時間為10min。

3.2 樂果的濃度在1×10-8～1×10-3mol/L內與小麥酯酶的抑制率呈線性關系，計算出回歸方程為lgI= 13.02x+118.7，相關系數為 0.995，最低檢出限為1.7×10-9mol/L。敵百蟲的濃度在 1×10-8～1× 10-3mol/L內與小麥酯酶的抑制率呈線性關系，計算出回歸方程為y=13.08x+112.7，相關系數為0.997，最低檢出限為1.1×10-8mol/L。

3.3 對照國家標準檢測方法得出的結論，采用檢測方程得出的樂果的檢測結果回收率為真實值的88.9%～92.3%，標準偏差為3.05%;敵百蟲的檢測結果回收率為真實值的87.9%～91.7%，標準偏差為3.24%。

3.4 對酶膜的重復使用次數進行了實驗，得出使用20次以內其酶活保存率為初始酶活的90%左右。

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Preparation and application of immobilized wheat esterase biosensors

WANG Hui-you1，WANG Tao1，WANG Zhen-yu1，2，YU Wei1
(1.Department of Food Science，College of Forest，Northeast Forest University，Harbin 150040，China; 2.College of Food，Harbin Institute of Techndogy，Harbin 150086，China)

The immobilized wheat esterase membrane was fixed at the glass electrode precise acidimeter probe to form a biosensor and detected the two kinds of usual organophosphorus pesticides of dimethoate and metrifonate. Result:in the range of dimethoate concentration 1×10-8～1×10-3mol/L，it had linear relation with wheat esterase’s inhibition rate.Regression equation was y=13.02x+118.7，correlation coefficient was 0.995，limit detectability(LDC) was 1.7×10-9mol/L.In the range of metrifonate concentration 1×10-8～1×10-3mol/L，it had linear relation with wheat esterase’s inhibition rate.Regression equation was y=13.08x+112.7，correlation coefficient was 0.997，limit detectability(LDC)was 1.1×10-8mol/L.In the actual sample detection，compared to the national standard method of control，we concluded that the recovery rate of using dimethoate detection equation was 87.9%～92.3%of the true value，and the repeated using number of bio-sensitive membrane resulted that in 20 times using the preserved activity was 90%of initial’s.The biosensors had the capacity of rapidity organophosphorus pesticide detection.

immobilization;wheat esterase;biosensing electrode probe;organophosphorus pesticide

TS210.1

A

1002-0306(2011)03-0385-05

有機磷類農藥，在我國農業生產上被大量使用。但其殘留物毒性較大，人長期攝入有機磷農藥可導致肝功能下降、血糖升高、白細胞吞噬功能減退等病理變化，并有致畸、致癌、致突變的作用，嚴重者可導致中樞神經系統功能異常，因此有機磷農藥殘留已成為中國的主要食品安全性問題［1-3］。解決此問題主要依靠建立一種準確快速、簡單廉價的農藥殘留檢測技術，這已經成為食品安全和環境保護的當務之急。傳統的有機磷農藥殘留檢測方法主要是色譜法，該法雖然測定精確、靈敏度高，但樣品前處理復雜，儀器龐大，設備昂貴，手續復雜，需專業人員進行操作，因此不適于經常性的現場檢測。而二十世紀六十年代以后迅速發展起來的生物傳感檢測技術以其快速、簡便、適合現場操作等特性滿足了對食品檢驗的要求［4-5］。由于大部分的生物傳感器都是由生物敏感膜和龐大的數據信號轉換裝置相連接所組成的，如熒光監測儀，光纖探測器等，所以此類生物傳感器并不適合有機磷農藥真正的現場檢測［6-7］。而采用精密型酸度計作為信號的轉換儀器，則可以很好地縮小檢測設備的體積，更加方便地進行現場的實驗檢測。本文對固定化小麥酯酶生物傳感器電極探頭的制備進行了研究，將生物敏感膜與精密型酸度計的玻璃探頭進行組裝，檢測時通過有機磷農藥對小麥酯酶的抑制程度與有機磷農藥濃度間的關系反映有機磷農藥的含量。同時，對檢測時的幾個重要參數進行實驗，找出了最佳的反應條件，為其在實際應用中提供一定的數據支持和參考依據。

2010-03-12

王會友(1982-)，男，碩士研究生，研究方向:生物技術及功能性食品開發。

東北林業大學研究生科技創新資助項目。