反膠束體系中酶增溶作用的研究進展

時冬梅，陳復生，趙俊廷，楊宏順

(河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450052)

反膠束體系中酶增溶作用的研究進展

時冬梅，陳復生*，趙俊廷，楊宏順

(河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450052)

論述了含酶反膠束體系的制備方法及影響因素、酶增溶于反膠束的結構模型;對酶增溶于反膠束的國內外研究現狀進行了詳細的綜述，并對其應用前景進行了展望。

反膠束，酶增溶，表面活性劑

反膠束萃取技術分離大豆蛋白和油脂與傳統分離技術相比具有明顯優勢:反膠束萃取過程可實現油脂和蛋白質的同時分離，大大簡化了蛋白和油脂分離工藝，減少固定資產投資，降低產品成本;分離過程不需要加入酸或堿，所用表面活性劑和溶劑循環使用，無廢水排放，因此解決了環境污染難題，同時無蛋白流失，產品得率高;萃取過程中，蛋白被反膠束內水環境包圍，環境接近細胞內的環境，蛋白不易變性，因而保持其生物活性且純度高;另外，利用酶的“超活性”，萃取過程可以同時進行蛋白質酶法改性，從而為大豆蛋白和油脂的同時分離開辟一條具有良好應用前景的新途徑。本文對酶增溶于反膠束的國內外研究現狀進行了詳細的綜述，并對其應用前景進行了展望。

1 反膠束酶體系

1.1 反膠束體系

表面活性劑分子由親水基(極性頭)和疏水基(非極性尾)兩部分組成。正常膠束指將表面活性劑溶解在水中，并使其濃度超過臨界濃度(Critical Micelle Concentration，CMC)時，表面活性劑在水溶液中聚集到一起而形成聚集體，反膠束是指表面活性劑在超過臨界膠束濃度時溶于有機溶劑，在少量水的存在下，為幾納米到幾十納米［1］。此“水池”具有加溶蛋白質和氨基酸等極性物質的能力，形成的納米尺度聚集體。在這個聚集體的中心有一個小“水池”，一般本文所提及的“加溶”指水(或溶液)進入反膠束極性核中，或指蛋白質溶解于反膠束的“水池”中。反膠束的形狀可能為球狀、橢球狀或圓柱狀［2］。

圖1 正常膠束與反膠束示意圖

當反膠束溶液與蛋白質水溶液或含蛋白質的固相接觸后，蛋白質可加溶于反膠束的“水池”中，稱為前萃取(或前萃，Forward Extration)(圖2)。將含有蛋白質的反膠束溶液與另一水相接觸，通過改變條件使蛋白質從反膠束相轉移到水相中從而分離出蛋白質，稱為后萃取(或后萃，Backward Extration) (圖3)。由于周圍水層和極性頭的保護，蛋白質失活或變性程度很小。

1.2 反膠束酶體系制備和影響因素

反膠束體系具有三種溶解環境:連續有機相、膠束界面和膠束水池。它類似于細胞內環境，使在其中的酶保持原有活性，甚至有時使酶表現出超活性。有機溶劑參與的酶催化反應常用于該體系，酶增溶于反膠束體系方法主要有注入法、液體萃取法和固體萃取法等。

圖2 前萃過程

圖3 后萃過程

a.注入法:這是將含有酶的緩沖溶液注入到表面活性劑有機溶劑中，然后攪拌至形成透明溶液而形成反膠束酶體系的一種常用方法，該方法可很好地控制反膠束的水含量(w0)。

b.液體萃取法:是將酶從主體水溶液中轉移到含有表面活性劑反膠束溶液中而形成反膠束酶體系的另一種方法。通常，該法制得反膠束酶的濃度較高。

c.固體萃取法:它是將反膠束溶液和固體酶直接混合攪拌，使酶進入反膠束體系的一種方法。該法使酶失活嚴重，一般很少使用。

圖4 反膠束酶體系示意圖

一般認為，酶在反膠束中的溶解作用，與酶表面電荷同反膠束表面電荷靜電作用及反膠束大小有關。所以，任何可增強這種靜電作用或導致形成較大反膠束的因素，均有利于酶在反膠束中溶解。實驗表明，影響反膠束酶體系形成因素有表面活性劑種類和濃度、體系中水含量、水相酸堿度、水相離子強度和酶分子大小等［3］。

1.3 反膠束酶體系結構及優點

1.3.1 反膠束酶體系結構 目前，脂肪酶和蛋白酶是研究最廣的兩種酶。關于酶增溶于反膠束中機理有三種不同結構模型(圖5):Luisi水殼模型(water shellmode1)［4］、Martinek誘導適合模型(induced fitmode1)［6］、固定尺寸模型(fixed-sizemode1)［5］。

a.水殼模型:Rmp＞Rm，rmp＞rp;b.誘導適合模型:Rmp＞Rm，rmp=rp(rp＞rm);c.固定尺寸模型: Rmp=Rm(rp≤rm)。

Rmp:含酶膠束直徑;Rm:未填充膠束直徑;rm:未填充膠束水池直徑;Rmp:含酶水池直徑;rp:酶分子直徑［6］。

由圖2可知，電壓互感器1、2、3、4、5、6、7、8、9和11號A相的量測數據序列之間的平均歐氏距離均小于閾值，而電壓互感器10的量測數據序列與上述電壓互感的量測數據序列的平均歐氏距離大于閾值，由此可以判定電壓互感器10，也就是賓敘一線A相的電壓互感器發生故障。

圖5 酶增溶于反膠束中的結構模型圖

1.3.2 反膠束作為酶增溶反應介質的優點 組成的靈活性;熱力學穩定性和光學透明性;反膠束有非常高的界面積/體積比，遠高于有機溶劑/水兩相體系，使底物和產物的相轉移變得極為有利;產物回收可通過相調變實現。反膠束的相特性隨溫度而變化，這一特性可用于產物回收。

2 反膠束酶體系增溶作用的研究進展

1977年，Martinek［7］等研究了胰凝乳蛋白酶在丁二酸二辛酯磺酸鈉(AOT)反膠束體系中的性質，這是關于反膠束酶學的正式研究報道。

到了20世紀90年代，反膠束技術被越來越廣地應用在食品行業。CHEN J P［8］用卵磷脂/奶油反膠束系統來酶水解奶油，得到的產品風味良好，且體系為食用級，代表了今后在食品科學上應用的方向，同時也開發出一些價格較低的反膠束體系［9-10］。

由于反膠束用于酶增溶作用介質具有組成靈活、熱力學穩定和光學透明，有利于產物和底物相轉移及產物回收等很多優點;學者在蛋白質的萃取分離和酶的固定化方面進行了深入研究。Wei Li等人利用反膠束合成α-胰凝乳蛋白酶/聚乙烯吡咯烷酮復合物，即將α-胰凝乳蛋白酶固定化，這樣使得其酶活要高于純酶的活性［11］。Manav B.Bera［12］用反膠束提取淀粉酶，得出表面活性劑AOT的濃度、KCl的濃度對淀粉酶的提取影響顯著，而pH對其幾乎沒影響;得出最佳的工藝條件:pH、AOT的濃度、KCl的濃度依次為10.43、0.05、1.00，提取率可達83.16%。

同時，一些學者介紹利用反膠束體系進行酶的純化并研究反膠束體系中酶的增溶作用，Konstantza Tonova［13］等介紹利用反膠束體系進行酶的純化并研究反膠束體系中酶的增溶作用，闡述α-淀粉酶和脂肪酶的純化與增溶作用。Rashid O.Anarbasev［14］等研究反膠束體系中DNA β-聚合酶在反膠束體系中的活性被提高，從而證明微環境對DNA β-聚合酶的活性有重要的影響。Camille J.Roche［15］等利用反膠束體系研究蛋白的水化特性，證明反膠束體系可以模擬活的細胞環境進行蛋白水化特性等研究。K.E. Nandini，Navin K.Rastogi對CTAB反膠束萃取脂肪酶的各種影響參數進行了研究，得到脂肪酶的活力、提取效率及純化倍數分別為82.72%、40.27%、4.09［16］。

另外，超活性一直是酶在反膠束體系中研究的主要方面。國內八十年代末期開始有翻譯介紹一些反膠束技術的文獻。此后，國內開始有反膠束萃取氨基酸、酶、蛋白質的報道。陸強、李寬宏［17］等人以CTAB/正己醇/正辛烷反膠束萃取體系，研究從水溶液中萃取牛血清白蛋白的動力學，測定了多種條件下的表觀傳質系數，從而判定萃取和反萃取過程各自的控制步驟。

20世紀末期到21世紀初，國內的學者對酶在反膠束中的超活性進行了主要研究，并對其影響因素進行探討。楊宏順［18］的研究表明，在反膠束體系中，蛋白酶與反膠束相互作用，表現出“超活性”，并建立了反膠束中酶的動力學模型。以全脂豆粉為原料，在不加酶的情況下蛋白一次萃取率為49.2%，在加入蛋白酶后，蛋白一次萃取率達到60%左右。苑艷輝［19］等對AOT/異辛烷反膠束體系萃取豆豉纖溶酶的前萃工藝進行了研究，酶活回收率62.9%，純化倍數8.5。許林妹［20］等研究了Gemini型陽離子表面活性劑反膠束體系萃取纖維素酶，萃取率達90%以上，酶活達到121.41%。Yun Zhang［21］等研究發現:木質素過氧化物酶在GGDE/TritonX-100-環己烷-H2O反膠束體系中催化活性比在AOT反膠束體系中高40倍。

近年來，國內學者在蛋白質的萃取分離和酶的固定化方面也進行了深入研究。柳暢先［22］等報道了用反膠束體系固定化醇脫氫酶(ADH)的研究，在此體系中，以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)作為表面活性劑，辛烷和己醇作為溶劑及助溶劑?？疾炝薃DH固定化的影響因素，確立了最佳固定化條件。姜崇斌等［23］利用堿性蛋白酶在十二烷基磺酸鈉(SDS)/異辛烷/正辛醇反膠束體系萃取蛋白的同時對蛋白進行酶解，研究了堿性蛋白酶的加入對萃取的影響，確定了最佳工藝。庹?。?4］等研究十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)-辛烷-己醇反膠束體系對乳酸脫氫酶(LDH)進行固定化，考察了含水量、CTAB和己醇濃度對LDH固定化的影響并得出最佳工藝條件，表明反膠束固定化LDH具有較好的熱穩定性。

3 增溶于反膠束中的酶的動力學規律

目前，已報道多種反膠束體系中的酶增溶作用動力學模型。這些模型可歸為擴散模型和非擴散模型兩類，其差別在于是否考慮擴散(diffusion)問題，也就是底物分子與酶分子分處于不同反膠束微粒中是否會影響或阻礙酶增溶反應的進行。

擴散模型由Verhaert和Oldfield提出，假設酶在反膠束內其動力學本征參數不變，酶在反膠束內行為的變化由底物接近程度的限制(擴散因素)引起。實際上酶在反膠束內獲得底物的方式是反膠束的融合，而這種物質交換的速率遠快于酶的反應速率。

非擴散模型由Kabanov和Bru提出，認為酶在反膠束內構象的變化導致動力學本征參數的變化。Kabanov假說反膠束存在最佳的大小使酶活力表達最高;Bru假說酶在反膠束體系的不同部位(自由水、束縛水、表面活性劑疏水尾和有機溶劑)時，表現的活力不同。這些假說都缺乏直接的實驗證據支持，而且引入參數較多，難以測定，所以迄今為止關于酶在反膠束內動力學規律的理論解釋仍有爭議。不過實際過程中，使用的底物濃度遠小于反膠束濃度，引起局域化濃度效應，這至少是反膠束內酶動力學性質變化的一個原因。

從表面上看，在反膠束體系中的酶增溶作用與在水溶液中沒有太大區別，也就是說，反膠束體系不能促進或阻礙反應中間態的形成。但是，在反膠束體系中對酶增溶反應的穩態前動力學研究是很困難的，所以，目前僅采用穩態法來測定Km與kcat值。

如果假定底物主要存在于核心水團中，則底物濃度可有兩種表示，即表觀濃度 (overallconcentration)與水相濃度(waterpool-concentration)，故Km也有Km，overall與Km，waterpool之分，由于對核心水團的直接研究較為困難，大多數報道的是表觀Km。對于水溶性底物來說，由于核心水團的體積很小，底物被濃縮許多倍，Km，overall比水溶液中的Km，bulk有所降低，這似乎是可以預見的現象。但是實際上在許多情況下，Km，overall反而增加，例如對于反膠束體系中的胰蛋白酶，當表面活性劑與底物所帶電荷相反時，Km，overall比Km，bulk增大很多。對于反膠束體系中的酶來說，其Km值與酶和反膠束的種類、增溶水量都有關，酶所表現出來的活性更接近于生物體環境。此時決定酶活性大小的是能與酶分子接觸的、能維持酶催化反應的底物量，而不是總體系中的底物的多少，此時的Km反映的也不僅是酶分子與底物之間的作用，而且包括微環境對底物的影響。

Nishiki［25］等研究了在AOT/異辛烷反膠束體系溶菌酶和苯丙氨酸通過液-液界面時前萃與后萃的傳質特征。

楊宏順［26］在研究反膠束中中性蛋白酶 AS1· 398反應機理中得到:實驗條件下反膠束中中性蛋白酶AS1·398的米氏常數約比水相中米氏常數小1個數量級，模型推導結果與實驗結果很接近，說明該模型可用于反膠束中以SPI為底物的AS1·398酶反應。

Yang Liu［27］等人指出，溶菌酶在AOT/異辛烷反膠束體系中的前萃與后萃過程與在邊界層內的擴散阻力和在界面上的釋放過程密切相關。

María A.Biasutti［28］等人研究酶增溶在表面活性劑中的反應動力學，對其增溶過程的各種影響參數進行分析，并強調了酶增溶于水相和有機溶劑過程中相似點和不同點。同時用目前存在的模型對其結果進行解釋。

由于反膠束體系的組成相對于水溶液要復雜得多，必須同時考慮核心水團、表面活性劑分子膜及有機溶劑對酶促反應的影響，因此，提出的模型也較為復雜，關于酶增溶于反膠束中的動力學和機理有待進一步的研究。

4 結語

由于反膠束用于酶增溶作用介質具有組成靈活、熱力學穩定和光學透明，有利于產物和底物相轉移及產物回收等很多優點;同時，也為親水性酶、相對疏水酶及疏水性底物或產物提供非常高的界面積/體積比，是一種新的生物催化劑固定化技術，近年來國內外學者在蛋白質的萃取分離和酶的固定化和分離純化方面進行了深入研究，多傾向于陰離子表面活性劑的應用［29-30］。以往的研究多集中在基礎方面，現已開始從基礎研究過渡到反膠束中酶增溶作用在藥物、食品添加劑、高分子材料的合成和有毒物質的降解等方面的應用研究［31-33］。

科研者對反膠束萃取氨基酸、酶等的影響因素、工藝過程作了相應的研究，取得了較大的進展［34-38］，證明該技術作為分離提純生物活性物質的一項新技術，不僅具有許多優越性，而且是可行的。但所涉及的大部分是小分子成分［39-40］(如ɑ-淀粉酶、溶菌酶等)，且其研究主要局限在液液萃取方面，而酶在反膠束體系中的增溶作用(液固分離)機理的研究報道尚少。此外，超活性一直是酶在反膠束體系中研究的主要方面。相信隨著對膠束酶學基本理論研究的不斷深入，通過研究增溶溶解于反膠束中的酶的動力學規律，可以闡明不同反膠束的微環境中酶活力的表達，以及底物和產物分配對酶活力發揮的影響，另外通過探索反膠束體系中酶增溶作用和對蛋白質改性的“超活性”作用機理，可以探討出蛋白質分子空間結構和分子量大小與反膠束“水池”微觀結構(“水池”體積、形狀等)相互關系的規律，為探討反膠束體系中酶增溶作用機理奠定基礎，從而實現而且將加快反膠束中酶增溶作用的工業化應用。

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Research advances in enzyme solubilization reaction in reverse micelle

SHI Dong-mei，CHEN Fu-sheng*，ZHAO Jun-ting，YANG Hong-shun
(Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

The system of reverse micelles containing enzyme preparation methods and influencing factors，the structure model of enzymes dissolved in reverse micelles was discussed in this paper.And the newest study on development of enzyme solubilization reaction in reverse micelles was introduced and the prospect was given for its application.

reverse micelles;enzyme solubilization;surfactant

TS201.2+5

A

1002-0306(2011)03-0424-05

2010-03-09 *通訊聯系人

時冬梅(1985-)，女，研究生，研究方向:食品資源開發與利用。

國家自然基金項目(20976037);國家教育部科學技術重點資助項目(205094);河南省杰出人才創新基金項目(05210005000)。