巨桉抗枝癭姬小蜂與SSR關聯的初步研究

張苗苗，莫曉勇，黃煥華，黃詠槐，甘四明

巨桉抗枝癭姬小蜂與SSR關聯的初步研究

張苗苗1,2,3，莫曉勇1，黃煥華2，黃詠槐2，甘四明3

(1. 華南農業大學林學院，廣東 廣州 510642；2. 廣東省林業科學研究院，廣東 廣州 510520；3. 中國林業科學研究院熱帶林業研究所，廣東 廣州 510520)

利用35個SSR標記，分析了巨桉(Eucalyptus grandis) 4個種源的遺傳變異，鑒定了與枝癭姬小蜂(Leptocybe invasa)抗性相關的SSR位點。共檢測到469個等位片段，平均每位點的等位片段數(NA)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態性信息量(PIC)分別為13.3、0.5385、0.8101和0.7797，供試群體的遺傳多樣性較高；分子方差分析(AMOVA)表明，種源內個體間變異占96.0%，種源間變異占4.0%，這與群體間較低的分化系數(Fst=0.0623)和較高的基因流(Nm=4.09～14.13)一致。聚類分析表明，種源14393與種源15358的親緣關系最近(Fst=0.017)，種源14393與種源20261最遠(Fst=0.058)。關聯分析檢測到EST-SSR226與枝癭姬小蜂抗性顯著相關(P=0.03)，對抗性的決定系數達0.4436，增效效應為0.71，增效比例42.8%。

巨桉；SSR；遺傳多樣性；關聯分析；枝癭姬小蜂

桉屬Eucalyptus是熱帶和亞熱帶地區栽培面積最廣和最成功的樹種，全世界人工林面積達到1 900萬hm2[1]。其中，巨桉E. grandis具有很強的適應性，生長迅速，樹形優良，木材用途廣泛，是桉屬中栽培面積最廣的一個樹種[2]。

但是，巨桉是枝癭姬小蜂Leptocybe invasa的主要寄主之一[3]。枝癭姬小蜂屬膜翅目Hymenoptera小蜂總科Chalcidoidea姬小蜂科Eulophidae，是2000年發現、2004年才定名的新屬新種[4]，并被歐洲和地中海植物保護組織(European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO)列為桉樹危險性害蟲[5]。枝癭姬小蜂主要危害桉樹的葉柄和中脈、產生蟲癭，或者嫩梢呈現叢枝狀，輕者可致枝葉變形和生長遲緩，重者可致植株死亡。目前，已對枝癭姬小蜂開展了化學防治、物理防治和生物防治的研究，均未收到明顯效果[6-11]。因此，抗蟲品種的應用成為該病最經濟有效且更具潛力的防治途徑[12]。

關聯分析又稱關聯作圖或連鎖不平衡(Linkage disequilibrium, LD)分析，它以位點間LD分析為基礎，鑒定種質資源或自然群體內性狀與候選位點間的關聯。關聯分析具有以下特點：(1) 以現有自然群體為材料，無需構建專門的作圖群體；(2)開發自然變異，并可同時檢測同一基因位點的多個等位基因；(3) 利用歷史重組，作圖分辨率高。例如，Thumma等[13]運用關聯分析法在藍桉(E.globulus)中鑒定出與微纖絲角顯著關聯的單核苷酸多態性位點。目前，國內外對桉樹枝癭姬小蜂抗性的分子遺傳研究尚無報道，通過關聯分析尋找抗性相關位點有助于快速填補這一空白。并且，抗性位點的獲得將大大推進抗蟲品種培育的進程，分子標記技術輔助選擇基因型可以提高育種效率[14]。

本研究擬利用簡單重復序列(Simple sequence repeats, SSR)標記分析巨桉4個種源的遺傳變異，鑒定與枝癭姬小蜂抗性相關的SSR位點，以期為桉樹抗枝癭姬小蜂的分子育種提供有效的分子標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與性狀觀測

參試材料為巨桉4個種源的46個家系(表1)，1株/家系，種子購自澳大利亞林木種子中心。2010年10月育苗，2011年7月調查單株受枝癭姬小蜂侵染的程度，根據受害癥狀分為5個等級：1，50個蟲癭以上；2，10～49個蟲癭；3，10個蟲癭以下；4，無蟲癭、頂梢叢枝狀；5，無癥狀。

1.2 SSR標記實驗

采用改良CTAB法[15]提取嫩葉DNA。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰且無拖尾。采用ND1000 (Thermo Scientific)測定DNA濃度和純度。

從尾葉桉遺傳圖譜[16]較均勻地選取35個SSR標記(表2)，包括13個基因組SSR標記(前綴為Embra)[17]、19個通過表達序列標簽(Expressed sequence tag, EST)的PCR產物克隆測序開發的SSR標記(簡稱EST-SSR)[14]和3個通過EST的PCR產物直接測序開發的EST-SSR (前綴為EUCeSSR)[18]?？紤]到標記位點在遺傳圖譜上的較均勻分布，即使在同一連鎖群上也相距較遠，可以認為位點間不存在LD。引物由上海生工生物工程公司合成。

PCR反應體系、擴增條件和標記分型參考Li等[19]。10 μL 反應體系包括 1 μL 10′ 緩沖液、25 μM各dNTP、前向和后向引物各0.5 μM、MgCl2濃 度1.5或2.0 mM、 熒 光dUTP 10 pmol、Taq DNA聚合酶(申能博彩生物科技有限公司) 1 U和DNA模板10 ng。PCR反應在Bio-Rad S1000上進行，采用降落PCR程序，94 ℃ 4 min；20個循環：94 ℃ 30 s，Tm+10 ℃～ Tm℃ (表2)每個循環降低0.5℃、30 s，72℃ 1 min；26個循環：94℃ 30 s，Tm ℃ 30 s，72℃ 1 min；72 ℃ 10 min。標記分型在ABI 3130xl測序儀(Applied Biosystems)上進行，取 2 μL PCR 產物、0.16 μL GeneScan 500LIZ內標 (Applied Biosystems)、7.84 μL 高純甲酰胺混勻，95 oC變性5 min、迅速冰浴，按測序儀操作手冊檢測樣品，數據收集軟件為GeneMapper 4.1(Applied Biosystems)。

1.3 數據分析

對各SSR位點，利用軟件PowerMarker v3.25[20]計算多態性信息量(Polymorphic information content, PIC)，利用軟件GenAlEx v6[21]計算等位片段數(Number of alleles, NA)、觀測雜合度(Observed heterozygosity, Ho)、期望雜合度(Expectdd heterozygosity, He)、種源間的分化系數(F-statistics, Fst)和固定化指數(Fixation index, F)以及各對種源間的Fst和基因流(Number of migrants,Nm)。對各種源，在Excel中計算所有SSR位點的NA、Ho、He和F的平均值和標準誤。采用GenAlEx v6進行種源間和種源內的分子方差分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)。種源間Euclidean遺傳距離利用PowerMarker v3.25[20]計算，并輸入軟件MEGA v4[22]采用非加權分組算術平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)[23]進行聚類分析。

表2 SSR位點、PCR的Mg2+濃度和退火溫度(Tm)以及位點多態性Table 2 SSR marker loci, PCR condition (Mg2+concentration and Tm) and marker polymorphisms

利用軟件Structure v2.2[24]進一步分析群體遺傳結構，假定SSR位點都是獨立的，選用混合線性模型和無起源模型，設定亞群數目(K)為2 ～ 7，每一個K值獨立運行7次，計算各單株的基因組變異源于第K亞群的概率(Q值)；將馬爾可夫鏈蒙特卡爾法(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)開始時的不作數迭代設為100 000次，不作數迭代后的MCMC也設為100 000次，根據檢測亞群數量的指標(DK值)最大值確定合適的K值[25]。劃分亞群時，把單株歸屬某個亞群的Q值臨界值設為0.6。

利用軟件TASSEL v2.1[26]的一般線性模型模塊，把各單株Q值作為協變量，對標記等位變異與抗蟲性狀的關聯進行回歸分析，回歸方程如下：

式（1）中：Yj是第j個單株的抗蟲等級；Ipj是第j單株第p等位變異出現的指示變量；β是群體各位點各等位變異的平均效應；X1j～Xkj是第j單株的基因組變異源于第1～K亞群體的概率Q值；β1～βk是亞群體各位點的等位變異的平均效應；E是殘差。

獲得關聯位點后，參考Breseghello和Sorrells[27]提出的方法，根據位點無效等位基因的表型推斷有效等位基因效應，確定增效等位變異和減效等位變異；參考文自翔等[28]的方法，計算某位點全部增效和減效等位變異的平均效應作為該位點的表型效應值，并計算各等位變異對表型效應的增效或減效比例。

2 結果與分析

2.1 巨桉種源對枝癭姬小蜂的抗性

巨桉4個參試種源對枝癭姬小蜂的抗性等級平均為2.4。但不同種源的抗性存在一定差異，從高到低依次為種源15358 (2.8)、種源14509 (2.7)、種源14393 (2.2)和種源20261 (2.1)。另外，種源內個體間抗性分化也較大。

2.2 SSR位點的多態性

總的來說，參試的SSR位點多態性較高。35個SSR位點共產生469個等位片段，平均NA為13.3個/位點(表2)；等位片段最多的位點是ESTSSR893和EST-SSR909 (各21個等位片段)，最少的是EST-SSR1001 (4個)。Ho介于0.3043 (ESTSSR226 和 EST-SSR1117) ～ 0.8696 (Embra8)， 平均 0.5385/位點；He介于 0.5929 (EST-SSR620) ～0.9322 (Embra203)，平均0.8101/位點；PIC介于0.5446 (EST-SSR620)～ 0.9169 (Embra203)，平均0.7797。這些參數均表明巨桉群體的遺傳多樣性水平較高。Fst介于0.0155 (EST-SSR35)～0.1842(Embra83)，平均0.0623，表明種源間的分化較低(6.23%)。F介于 -0.0942 (EST-SSR1001)～ 0.6088(Embra203)，平均0.3218，表明巨桉4個種源內近交水平相對較高。各位點的具體參數見表2。

2.3 種源的遺傳多樣性和群體結構

4個種源的多樣性水平相似(表3)。種源20261雖然平均單個位點的NA最低，但Ho和He卻最高；種源15358具有最高的平均NA，但Ho卻最低；種源14393具有最低的平均F值，表明近交水平最低。

表3 巨桉4個種源的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity for four provenances of E. grandis

AMOVA分析表明(表4)，巨桉種源內個體間變異占總變異的96%；種源間只有4.0%，這與所有SSR位點的平均Fst (6.23%)較一致。這也表明巨桉遺傳變異的絕大部分來自種源內個體間，而種源間的變異相對極小。

表4 巨桉種源的AMOVA分析Table 4 AMOVA analysis on four E. grandis provenances

UPGMA聚類分析表明(圖1)，種源14393與15358最先聚為一類，其次才與種源14509聚類，最后與種源20261聚類，表明種源14393與15358的親緣關系最近，而其與種源20261的親緣關系最遠。這也與種源間的Fst和Nm值一致(表5)，如種源14393與15358之間具有最小的Fst (0.017)和最大的Nm (14.13)，而種源14393與20261之間則具有最大的Fst (0.058)和最小的Nm (4.09)。

圖1 巨桉4個種源的UPGMA聚類Fig. 1 UPGMA dendrogram of four E. grandis provenances

表5 巨桉種源間的Fst和Nm值?Table 5 Pairwise Fst and Nm values between four E. grandis provenances

2.4 抗枝癭姬小蜂與SSR標記的關聯分析

確定亞群數量中，當K=5時DK值最大，故將巨桉單株分為5個亞群，分別為Q1、Q2、Q3、Q4和Q5 (圖2)。取單株Q值的臨界值為0.6，可將43株(93.5%)歸屬于這5個亞群，各亞群分別包含7、12、10、6和8株單株(表6)。

表6 巨桉單株的亞群劃分Table 6 Five sub-populations of number of E. grandis single tree

圖2 利用Structure軟件檢測的巨桉5個亞群Fig. 2 Five E. grandis sub-populations identified with software structure

關聯分析檢測到EST-SSR226與枝癭姬小蜂抗性相關聯(P=0.03)，對性狀的決定系數達到了0.4436，增效效應為0.71，增效比例達42.8%。

3 結論與討論

巨桉單株對枝癭姬小蜂的抗性存在分化，這為抗性品種的選擇提供了種質材料，也為尋找與抗性關聯的分子標記提供了遺傳基礎。

關聯分析易受供試材料的遺傳多樣性影響，需在關聯分析前對供試群體進行遺傳多樣性分析[29]。本研究利用35個SSR位點對巨桉4個種源的分析表明，該4個種源多樣性較高，種源間遺傳分化較小。這與Okun等人[30]2008年進行的巨桉遺傳多樣性研究結果一致。這也與巨桉的異交繁育系統有關，異交對種源內和種源間的基因流動有促進作用[31]。巨桉4個種源較高的遺傳多樣性和較小的遺傳分化也表明其適合關聯分析。

本研究首次報道了桉樹抗枝癭姬小蜂關聯的基因組位點。鑒定出的關聯位點EST-SSR226的決定系數達0.4436、增效效應達0.71、增效比例達42.8%。該位點在將來桉樹抗枝癭姬小蜂的標記輔助育種中應具一定的應用潛力。

但是，受限于研究群體較小，本研究鑒定出的關聯位點有待利用更大的群體進行驗證。并且，所用的標記數量較少，需要利用更多的候選標記以尋找更多的、決定系數和增效效應更大的標記位點。這是下一步工作需要解決的問題。

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Preliminary study on SSR markers associated with resistance to Leptocybe invasa in Eucalyptus grandis

ZHANG Miao-miao1,2,3, MO Xiao-yong1, HUANG Huan-hua2, HUANG Yong-huai2, GAN Si-ming3
(1. Forestry College, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China; 2. Guangdong Academy of Forestry,Guangzhou 510520, Guangdong, China; 3. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520,Guangdong, China)

Thirty-five simple sequence repeat (SSR) markers were used to assess genetic diversity of four Eucalyptus grandis provenances and identify markers significantly associated with resistance to gall wasp (Leptocybe invasa) in E. grandis. A total of 469 alleles were produced with the 35 SSRs, averaging at 13.3 alleles per marker. The mean values of observed heterozygosity (Ho), observed heterozygosity (He) and polymorphic information content (PIC) were 0.5385, 0.8101 and 0.7797, respectively, across all the SSR loci,indicating a high level of genetic diversity. AMOVA analysis revealed that genetic variation among individuals within provenances accounted for 96.0% of the total molecular variance and 4.0% of the variance occurred among provenances, which coincided well the low Fst(0.0623) and high Nm(4.09 ～ 14.13). UPGMA cluster analysis shows that provenances 14393 and 15358 were the most close (Fst=0.017) whereas provenances 14393 and 20261 were the most distant (Fst=0.058). The marker EST-SSR226 was identified to associate with resistance to gall wasp (P=0.03), with a determination coefficient 0.4436, positive effect 0.71 and positive effect percentage 42.8%.

Eucalyptus grandis; SSR; genetic diversity; association analysis; Leptocybe invasa

S792.39

A

1673-923X(2012)11-0131-05

2012-10-10

廣東省自然科學基金項目 (10151064201000027)；國家高技術研究發展計劃(863計劃) (2011AA100202)；廣東省林業科技創新專項 (2011KJCX025-01)

張苗苗(1988-)，女，河南鶴壁人，碩士研究生，研究方向為森林培育

莫曉勇(1962-)，男，四川達縣人，教授，主要研究方向為森林培育和人工林經營；E-mail：xyscut2006@yahoo.com.cn

[本文編校：歐陽欽]