claR基因的擴增對棒狀鏈霉菌棒酸合成的影響*

左志晗，趙海龍

(天津師范大學生命科學學院，天津市細胞遺傳與分子調控重點實驗室，天津，300387)

克拉維酸又名棒酸，是棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)的代謝產物。其分子式為C8H9NO5，分子質量為199［1］，在分子結構上是由β-內酰胺環與噻唑環構成的雙環體系，為一稠合雙環 β-內酰胺結構［2－3］?？死S酸本身的抗菌活性很弱，但它具有強力、廣譜且不可逆的β-內酰胺酶抑制活性［4］。

由于抗生素的大量使用，導致了細菌對很多藥物的抗藥性，這己成為臨床上治療細菌性疾病的一個越來越棘手的問題?？死S酸因其獨特的抑制β-內酰胺酶的活性，既抑制了耐藥細菌的酶活性，又增強了這類抗生素的廣譜抗菌作用。我國細菌耐藥的嚴重程度已位居世界前列，但當前在我國臨床上使用的上述復方β-內酰胺類抗生素來源主要是進口產品和合資企業的產品，并且微生物發酵是目前克拉維酸生產的主要途徑［5］。因此提高棒狀鏈霉菌克拉維酸產量的研究目前備受關注。

隨著克拉維酸生物合成途徑及基因調控的逐漸明確，在常規誘變、原生質體融合的基礎上可以寄希望于通過基因工程的方法來獲得克拉維酸高產菌株。由于克拉維酸的生物合成受到級聯調控，故某些調控基因的變化可能會使克拉維酸產量獲得提高［6］。

claR基因，位于克拉維酸基因簇中orf-7的下游，方向與cas2相反。它編碼一個46.6 ku的多肽，該物質同許多LysR家族的轉錄調控因子具有同源性［7］，其中與SnpR最相似，SnpR是S．lividans產生的一種蛋白，該蛋白可對編碼一種中性蛋白水解酶的基因進行調控［8］。研究表明，claR的C末端與其它所有LysR的N末端具有相似性，

該區域包含一螺旋－轉角－螺旋基元，起結合靶DNA從而激活轉錄的作用。claR的失活將產生頭霉素C合成增加，克拉維酸合成缺失的突變，這種突變可積累克拉維胺酸。這表明claR影響克拉維酸后面合成步驟的基因，即由克拉維胺酸向克拉維酸的轉化。

本研究選取棒狀鏈霉菌的claR為目標基因，構建了含claR基因的重組質粒pSET152-claR，對棒狀鏈霉菌的claR基因進行了擴增，并對所得的突變菌株的克拉維酸產量變化進行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

克拉維酸產生菌棒狀鏈霉菌S．clavuligerus NRRL3585，由沈陽藥科大學何建勇教授惠贈;大腸桿菌DH5α和ET12567(pUZ8002)均為本實驗室保存菌種。

PCR產物克隆載體 pUCm-T(AmpR)，購自Sangon公司;大腸桿菌-放線菌穿梭質粒表達載體pSET152，由加拿大阿爾伯塔大學Annie教授惠贈提供。

1.2 培養基

LB培養基［9］，用于大腸桿菌的培養，ET12567 培養基是在LB培養基中加入阿泊拉霉素(Am)、氯霉素(Cml)和卡那霉素(Km)，使其終濃度分別為25 μg/mL，25 μg/mL，50 μg/mL;YMGA 培養基［10］、TSB培養基［11］及SS培養基［11］分別用于棒狀鏈霉菌的產孢培養、種子培養及發酵培養。大腸桿菌－鏈霉菌接合培養基采用改良AS-1培養基［12］，即參照Baltz等人［13］的方法進行了改良。篩選接合轉移子是在改良AS-1培養基中添加阿泊拉霉素和萘啶酮酸，二者的使用濃度均為25 μg/mL。

1.3 酶和試劑

限制性內切酶、T4-DNA連接酶、Taq DNA聚合酶均購自大連寶生物工程有限公司;Long Taq DNA聚合酶購自天為時代;溶菌酶、蛋白酶K購自上海生工生物工程有限公司;克拉維酸標準品購自中央藥品檢定所，其他試劑均購自Sigma公司。

1.4 DNA體外重組

鏈霉菌總DNA提取、大腸桿菌和鏈霉菌屬間接合轉移方法參照文獻［14］和文獻［11］進行;大腸桿菌質粒提取和轉化參照文獻［15］進行。DNA限制性酶解片段的分離純化及PCR產物的純化均采用寶生物工程有限公司的DNA凝膠回收試劑盒，按其產品說明書進行。

以棒狀鏈霉菌的總DNA為模板，利用 PCR擴增技術獲得1.7kb的一段帶有啟動子的claR基因片段。參照文獻［16］報道的棒狀鏈霉菌調節基因claR的相應核苷酸序列，設計上下游引物(引物委托北京奧科生物工程有限公司合成):引物1:5＇-CGGGACCGTATGTCCCGGGGCCGGA-3＇，引物 2:5 ＇-CGCCCCACCGACCAGGTCTGACACC-3＇。PCR 反應條件:94℃ 2 min，61℃1 min，72 ℃ 2 min，30 個循環;72 ℃延伸15 min。

1.5 棒狀鏈霉菌的發酵培養及發酵液中克拉維酸的檢測

挖取YMGA斜面上的Streptomyces clavuligerus菌絲體接于TSB種子培養基中，于180r/min，28℃培養48h，然后轉接于裝有SS發酵培養基的擋板三角瓶中，180 r/min，28℃培養，分別在不同培養時間取樣檢測棒酸含量。

發酵液中克拉維酸的檢測采用HPLC方法檢測，具體步驟參照文獻［17］。

2 結果

2.1 PCR克隆及重組質粒pSET152-claR構建

按圖1所示技術路線構建基因表達載體pSET152-claR。以棒狀鏈霉菌的染色體為模板，claR基因的上下游引物進行PCR擴增，得到1.7 kb的一段帶有啟動子的claR基因片段，將該PCR反應產物用T4 DNA連接酶連接到pUCm-T載體上，得到重組質粒pUCm-T-claR，轉化E．coli DH5α感受態細胞，涂布于含 IPTG(終濃度1 mmol/L)、X-gal(終濃度40 μg/mL)和Amp(終濃度100 μg/mL)抗性的LB平板上篩選藍白斑。隨機挑取10個單克隆白斑，擴大培養后提取質粒，EcoRI-BamHI雙酶切鑒定后，DNA測序。

對經測序正確的pUCm-T-claR進行EcoRIBamHI酶切，回收1.7 kb的claR基因片段，與經過同樣酶切的載體pSET152進行連接，連接產物轉化E．coli DH5α，經質粒提取，對重組質粒進行酶切驗證，結果見圖2。

由圖 2可知，采用 EcoRI-BamHI雙酶切pSET152-claR后得到1條1.7kb的DNA片段和1條5.5kb的 DNA片段，分別與 claR基因及載體pSET152的理論大小相吻。并且以EcoRI和BamHI分別單酶切pSET152-claR，產物大小一致且均在7～8kb之間，與理論值 7.2kb相符，表明重組質粒pSET152-claR結構正確。

2.2 接合轉化子的獲得

將質粒pSET152-claR轉化到大腸桿菌ET12567(pUZ8002)中，與棒狀鏈霉菌進行屬間接合轉移，得到較多的接合轉化子，挑取阿泊拉霉素抗性接合子至含有25 μg/mL萘啶酮酸和含有25 μg/mL阿泊拉霉素的培養基上進行純化，純化后的接合轉移子在無抗生素的YMGA培養基上進行松弛培養至充分產孢。收集孢子，進行系列梯度稀釋。選擇合適濃度的孢子涂布在不含阿泊拉霉素的培養基上進行連續傳代，最后影印到含有抗生素阿泊拉霉素的培養基上，篩選得到仍具有阿泊拉霉素抗性的菌株1株，命名為S．clavuligerus∷claR。

2.3 轉化子的驗證

重組質粒pSET152-claR轉入 S．clavuligerus后，通過pSET152上的attP位點，整個質?？梢蕴禺愋缘牟迦氲芥溍咕蚪M中的attB位點，從而將其攜帶的claR同時插入到S．clavuligerus的attB位點(圖3)，從而使其增加了一個拷貝的 claR基因。pSET152-claR與出發菌株的染色體同源區域發生同源雙交換的示意圖如圖3所示。

參照棒狀鏈霉菌attB位點兩側的序列設計一對引物(圖3)P3:5’-AGCGGCCAAAGGGAGCAGACTGTAA-3’;P4:5’-CAGGATTCGAACCTGGGAAGGCTGA-3’，對出發菌株 S．clavuligerus及 S．clavuligerus∷claR的基因組 DNA分別進行 PCR驗證，結果如圖4。

圖1 重組質粒pSET152-claR的構建過程

圖2 重組質粒pSET152-claR的驗證

圖3 pSET152-claR插入 S．clavuligerus染色體的示意圖

圖4 突變株S．clavuligerus∷claR的PCR驗證

由圖4可知，以引物3和引物4對出發菌株S．clavuligerus的基因組DNA進行PCR結果未能檢測到PCR產物(attB兩引物之間只有60bp)，而以S．clavuligerus∷claR的基因組DNA為模板的PCR產物在7～8kb之間，與理論值7.2kb(7.2kb的pSET152-claR插入 S．clavuligerus的 attB位點)相吻合，說明pSET152-claR已整合插入到S．clavuligerus的attB位點。

2.4 S．clavuligerus claR產酸能力的測定

對出發菌株 S．clavuligerus及 S．clavuligerus∷claR分別進行發酵培養，不同發酵時間取樣測定其克拉維酸產量，結果見表1:突變菌株S．clavuligerus:claR的克拉維酸產量在發酵120 h時達到最高，可達606.06 mg/L，較原始對照菌株提高了86%。

2.5 S．clavuligerus∷claR的遺傳穩定性實驗

將突變菌株S．clavuligerus∷claR在YMGA培養基斜面上進行傳代培養，每轉接一次同時轉入發酵培養基中，搖瓶發酵培養120h后HPLC法測定克拉維酸的效價，結果如表2所示。

表1 突變菌株及原始菌株發酵液中克拉維酸產量的HPLC測定結果

表2 S．clavuligerus∷claR的遺傳穩定性

由表2的傳代實驗結果可知，S．clavuligerus∷claR在6代之內產酸量較穩定，繼續傳代，則雖然菌種的抗性標記非常穩定但產酸量呈下降趨勢，所以發酵培養應盡量控制傳代次數在6代以內。

3 討論

對于日益嚴重的β內酰胺類抗生素的耐藥問題，棒酸因其具有強力、廣譜且不可逆的β-內酰胺酶抑制活性，已作為特效藥物被廣泛用于臨床，本研究嘗試用分子生物學的方法定向改造原始生產菌的基因組:棒狀鏈霉菌的claR基因拷貝對其克拉維酸的產量具有正調控作用，因此本實驗嘗試增加棒狀鏈霉菌中的claR基因拷貝以提高克拉維酸的產量。采用接合轉移的方法將重組質粒pSET152-claR轉入了野生型S．clavuligerus中，由于載體pSET152含有一個attP位點，可以特異性的插入到鏈霉菌基因組中的attB位點，實現了在S．clavuligerus基因組中增加一個拷貝claR基因的目的，所得的突變株S．clavuligerus∷claR產酸量最高可達606.06 mg/L，較出發菌株提高了85.8%，菌株在6代之內的產酸量基本穩定，表明所構建的基因工程菌株穩定性較高，易于進行工業化生產。本研究為從分子水平改造菌種提供一個例證，對棒酸產量的提高提供一種可行的依據。

要實現ccaR基因的高效表達，選擇合適的表達載體至關重要，本實驗曾分別選擇了鏈霉菌表達載體pIJ86和pSET152對claR進行表達，兩種表達載體均為接合轉移型質粒，其中pIJ86為高拷貝大腸桿菌－鏈霉菌穿梭質粒，其多克隆位點上游帶有ermEp*強啟動子，可實現克隆基因的高拷貝表達，采用pIJ86作為表達載體，讓重組質粒在棒狀鏈霉菌中復制，可以獲得多個拷貝的claR基因，有效提高克拉維酸產量，但缺點是重組質粒在鏈霉菌中不穩定，容易丟失，且在菌體的培養過程中要始終加入抗性篩選壓力，不利于工業化規模的生產;而載體pSET152含有一個attP位點，可以特異性的插入到鏈霉菌基因組中的attB位點，該方式是整合到基因組上的插入方式，所構建的基因工程菌株穩定性較高，易于進行工業化生產。

本研究曾選擇了對棒狀鏈霉菌紫外誘變所得的克拉維酸高產菌株S．clavuligerusB71-14的ccaR進行表達，實現了在S．clavuligerusB71-14基因組中增加一個拷貝ccaR基因的目的，所得的突變株S．clavuligerus∷ccaR 較出發菌株提高了 54%［18］;S．clavuligerus的claR擴增后與經紫外誘變獲得的高產菌株S．clavuligerusB71-14的ccaR擴增后相比克拉維酸產量提高的幅度更高，并不能表明擴增claR比擴增ccaR提高克拉維酸產量的能力更強，因為相對高產的克拉維酸產生菌S．clavuligerusB71－14，已經經過了反復的菌種誘變和篩選過程，其生物合成克拉維酸的能力已經有所提高，或者受過誘變處理的菌株，某些基因己經發生突變，使得克拉維酸合成提高的幅度不大，要想解釋清楚這一現象，還需要進一步研究。

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