發酵促進劑在三孢布拉霉生產番茄紅素中的應用*

師艷秋，辛秀蘭，袁其朋

1(北京化工大學生命科學與技術學院，北京，100029)2(北京電子科技職業學院生物技術系，北京，100029)

番茄紅素是一種重要的脂溶性類胡蘿卜素，具有很強抗氧化、清除自由基、抗癌抑癌、增強機體免疫、延緩衰老和預防心血管疾病等重要的生理功能［1］，是一種很有發展前途的新型功能性天然色素。它的生產方法主要有3種:天然植物提取法、化學合成法和微生物發酵法。天然提取法以天然植物為原料，經有機溶劑提取或超臨界萃取制取類胡蘿卜素，但由于原料含量太低，生產成本居高不下［2］?；瘜W合成法可商業生產β-胡蘿卜素和番茄紅素等類胡蘿卜素，雖然生產成本低，但產品吸收率較低，而且人們對化學合成品毒副作用的擔心，限制了其市場的發展［3］。微生物發酵法與天然植物提取法和化學合成法相比，具有產量高、成本低、產品無毒副作用、體內吸收率高等優點，是目前番茄紅素生產的主要方法［3］。毛霉目真菌三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)是世界上最常用的β-胡蘿卜素高產菌株。根據Blakeslea trispora的代謝途徑，若在發酵過程中添加合適的阻斷劑，阻斷番茄紅素到β-胡蘿卜素的代謝途徑，就可以促進番茄紅素的積累［4］?？捎葿lakeslea trispora生產的番茄紅素已被聯合國糧農組織(FAO)、食品添加劑委員會(JECFA)和世界衛生組織(WHO)認定為A類營養素，并被50多個國家和地區作為具有營養與著色雙重作用的食品添加劑，廣泛應用于食品、醫藥和化妝品領域［5］，在歐美保健食品市場上供不應求。因此，用微生物發酵生產番茄紅素的研究也日益受到重視。

選育構建高產菌種及優化發酵條件，是利用生物技術生產類胡蘿卜素不可缺少的兩個方面(內外因關系)。研究和實踐表明，在已確定碳源、氮源及其用量等的基本培養基中，添加某些發酵促進劑對于促進發酵和增產往往具有事半功倍的效果［6］。

為此，筆者結合本實驗室承擔的提高番茄紅素發酵水平及其發酵機理研究課題所作的部分工作，結合國內外發酵促進劑作用于番茄紅素生產的研究現狀，對三孢布拉霉菌發酵生產番茄紅素中添加的各種促進劑及對番茄紅素生產的影響進行了綜述，并依據作用機制的不同，進行了系統地歸類總結。

1 性激素——三孢酸以及結構類似物

三孢酸是Blakelea Trispora(+)和(-)菌混合培養時產生的關鍵代謝產物，為Blakelea trispora、Phycomyces blakesleanus和Mucedo等毛曲霉目的性激素，對提高類胡卜素的合成能力有重要的作用。究其原因就是混合培養時，屬于有性繁殖，來源不同的“+”、“－”菌的菌絲體互相接觸，發生原生質和細胞核的結合，生成接合孢子，最后減數分裂形成單倍的營養體——三孢酸。發酵培養階段，在三孢酸刺激作用下，菌體合成大量類胡蘿卜素，從而提高了發酵產率。已有的研究結果也證實了它的促進作用，在利用Blakelea trispora發酵生產番茄紅素的過程中添加外源性的三孢酸，其發酵水平可提高2～15倍［7］。

不但三孢酸具有促進類胡蘿卜素生產的作用，就是 α-紫羅酮、β-紫羅酮、VA、脫落酸、異煙肼、琥珀酰亞胺、檸檬油萜烯和芳香族化合物的結構類似物也有此性質，它們的加入均能提高類胡蘿卜素的產量，從而提高番茄紅素的產量［8］。通過三孢酸結構類似物結構式的分析，可以確定當化合物必須具備1個環狀結構并帶1個酮基和1個的側鏈結構才具有這種生物活性。

2 抗氧化劑

番茄紅素易于氧化，因而在發酵過程中添加抗氧化劑會防止番茄紅素的氧化，從而提高產量。秦敬改［9］在研究抗氧化劑BHT對三孢布拉霉發酵生產類胡蘿卜素時發現，當添加1g/L的BHT時類胡蘿卜素產量提高30%。劉海麗［10］添加0.025%的抗氧化劑Ethoxyquin，發現對類胡蘿卜素產量的增長有顯著作用，可使產量增加70%。

3 氧載體與表面活性劑

在發酵生產番茄紅素中，三孢布拉霉是高度嗜氧的微生物，從發酵動力學方面去改善培養介質的性能，可以通過添加氧載體、表面活性劑［11］提高同一反應系統的傳氧系數來提高番茄紅素的產量。研究報道，添加非離子表面活性劑Span-20不僅可以改變三孢布拉霉菌發酵液流體特性和細胞通透性，而且更重要的是它是水溶性表面活性劑，形成的分散型菌絲體更加有利于細胞內外物質的傳遞并營造利于番茄紅素合成的有利條件，因而可使番茄紅素生產能力大幅度提高［12］。

朱艷［13］在發酵第1天的時候添加H2O2到發酵體系中，可以提高番茄紅素的產量達到40%。在發酵剛開始分別加入1%的氧載體——正己烷、正十二烷，可使產量分別提高25%和72%。并且在添加氧載體的同時，進行了各種表面活性劑的添加實驗，選取了 Span20、Tween20、Tween80和 Triton-x100為代表，進行了復合實驗，番茄紅素產量大幅提高，最高可提高114%，優于單一添加氧載體或表面活性劑。

王常玲［14］在發酵過程6h時，添加0.13%的表面活性劑大豆卵磷脂，番茄紅素的產量達到最大值1.58 g/L，比對照提高了56.44%。劉淑惠［15］研究了發酵液中加入活性炭，利用活性炭吸附氣體的性質，增加發酵液中溶解氧的濃度，改善發酵液黏度，促進三孢布拉霉菌的生長，番茄紅素的產量提高為原產量的150%以上。

4 前體物質

前體物質指某一代謝中間體的前一階段的物質。例如葡萄糖是糖原或乳酸的前體物質;原葉綠素是葉綠素的前體物質;原維生素是維生素的前體物質。一般在生物合成反應的中間過程中，某一階段前的物質，都可以說是該階段物質的前體物質。按慣例是不包括極簡單的原料物質的。在生物合成番茄紅素的過程中，初級代謝產物以及中間代謝產物都可以看作是番茄紅素的前體物質。

三孢布拉霉生物合成番茄紅素的途徑復雜，但是已基本探明了番茄紅素及相關類胡蘿素的生物合成途徑(圖1)。已有的研究表明，初級代謝中間產物檸檬酸、烏頭酸、蘋果酸和琥珀酸對番茄紅素的合成均有一定的促進作用，以檸檬酸的促進作用最為顯著［16］。王常玲［17］在發酵 24h 添加 2.0% 的檸檬酸時，番茄紅素的產量達到 0.99 g/L，比對照提高了39.43%。也有文獻報道，添加檸檬酸鹽和蘋果酸鹽可刺激三孢布拉霉菌體內類胡蘿卜素的合成［18］。

5 激活代謝途徑中的相關酶的活性的物質

5.1 青霉素

青霉素可以刺激MVA激酶的酶活(圖1)，從而可以增加類胡蘿卜素前體物質異戊二烯焦磷酸(IPP)的合成，有利于代謝流向番茄紅素合成轉移［16］。解書懷［18］在發酵后第一天添加1 mg/L 的青霉素，番茄紅素產量提高32%。

5.2 花生四烯酸(AA)

劉淑惠［15］在實驗過程中發現，添加AA(花生四烯酸，類二十烷酸的前體，類二十烷酸是很多生化過程中的重要調節劑)，可以提高番茄紅素產量，達到47%。添加依據是 Rodriguea-Concepcion等［19］使用AA處理過番茄后發現，HMGR(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A)還原酶被認為是MVA途徑中的第一個限速酶，是細胞質萜類化合物的代謝中的重要調控點)的活性提高了，并且促進了番茄紅素的合成。毛霉目真菌番茄紅素的代謝途徑與植物體內合成番茄紅素的代謝途徑相似，并且存在相同功能的一套代謝酶系。因此可知，花生四烯酸刺激并提高了真菌三孢布拉氏霉中的HMGR的活性，促進了番茄紅素的累積。

5.3 試劑A(HMG-CoA)

圖1 真菌中類胡蘿卜素的代謝途徑

在類胡蘿卜素生物合成途徑中，HMG-CoA reductase催化HMG-CoA形成甲羥戊酸(MVA)，由于MVA的形成是一個不可逆過程，因此，HMG-CoA reductase被認為是動物、植物、真菌可能也是昆蟲的類異戊二烯代謝途徑的一個限速酶。許多研究者都報道，異戊二烯生物合成途徑的誘導，尤其是倍半萜類物質的合成，與HMG-CoA reductase活性成正相關。在類胡蘿卜素生物合成途徑中(圖1)，試劑A可使HMG-CoA reductase酶活增加2倍，從而可以增加類胡蘿卜素前體物質異戊二烯焦磷酸(IPP)的合成，提高番茄紅素的產量。解書懷［18］在添加試劑A后，刺激三孢布拉霉類胡蘿卜素合成代謝途徑中試劑A代謝，使HMG-CoA reductase酶活提高兩倍，實驗結果表明:在發酵第1天添加0.05%的試劑A，可使番茄紅素產量提高31%，最大達到1.49 g/L。

6 金屬離子和鹽

微生物在生長繁殖和產物合成中都需要無機鹽和微量元素，而且這些離子的生物學作用各不相同。文獻報道:三布拉霉菌兩性株混合培養發酵時，添加微量(0.01 mol/L)銅離子、鎂離子、鐵離子可增加胡蘿卜素合成的速率，并使得終產物的產量增加幾倍。

Mg2+是物質代謝過程中許多酶的輔助因子或激活劑，參與酶促反應，激活酶活性，Mn2+對生物生長及次級代謝產物的生產具有較大的影響，而且Mn2+對番茄紅素的穩定性影響不大，徐軍偉［20］通過添加及改變培養基中的Mn2+、Mg2+量來考察微量元素對發酵的影響，結果如下:在發酵過程中添加Mn2+，菌體生物量和番茄紅素的產率與對照試驗相比都有較明顯的提高。說明Mn2+對發酵有較大的影響。發酵液中當濃度較低時，能夠促進菌體生長和番茄紅素合成，但當Mg2+過高時，菌體生物量和番茄紅素產率反倒降低，可能較高的Mg2+濃度對三抱布拉氏霉菌產生毒害作用，抑制菌體生長和產物合成。

7 番茄紅素環化酶抑制劑

番茄紅素環化酶是三孢布拉霉菌合成番茄紅素到β-胡蘿卜素所需的酶，生物法生產番茄紅素的關鍵步驟就是添加番茄紅素環化酶抑制劑，打斷番茄紅素至β-胡蘿卜素的環化反應，使代謝流停留在番茄紅素階段。常見的番茄紅素環化酶抑制劑有兩類:一類為叔胺類化合物，主要包括對二甲氨乙基苯酚、2-二甲氨基-乙醇、2-二甲氨基-1-丙醇、1-二甲氨基-2-丙醇、3-二異丙基氨基-1-丙醇、1-二異丙基氨基-2-丙醇、三乙胺、2-二甲氨基乙苯等［21］;另一類是含氮類雜環化合物，如煙堿、咪唑、吡啶、嗎啉、吡啶、哌啶、喹啉和某些取代衍生物［22］。目前由于叔胺類化合物毒性較大，在微生物法生產番茄紅素中較少應用。徐娜等［23］對不同阻斷劑作用效果進行比較，發現咪唑、煙堿、N-甲基嗎琳、吡啶及哌啶均可促進三孢布拉霉累積番茄紅素，但前三者的效果優于吡啶及哌啶，發酵產物中β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素較少?？紤]到工業生產成本，還考察了廢棄煙渣水抽提物對此菌產生番茄紅素的影響，結果表明在一定條件下，加入廢棄煙渣水提物可使番茄紅素的積累量從對照的1.42 mg/L增加到160.3 mg/L，具有良好的工業應用前景。

8 麥角固醇合成抑制劑

番茄紅素和麥角固醇的合成前體都是法尼基二磷酸(FPP)，通過控制麥角固醇的合成，來達到積累番茄紅素的目的(圖1)。麥角固醇合成抑制劑——十二環嗎啉、嗪氨靈、氟康唑、酮康唑 、鹽酸特比萘芬等，抑制合成麥角固醇酶的活性，使得麥角固醇產量降低，使得三孢布拉氏霉的類胡蘿卜素產量提高。孫穎［24］在發酵48h時添加0.7 mg/L的鹽酸特比萘芬和30 mg/L的酮康唑，可使番茄紅素的含量增加23%和277%。

9 結語

目前制約發酵法工業化生產番茄紅素的主要因素是微生物不能高水平的積累番茄紅素，導致發酵產率低、生產成本較高。番茄紅素合成途徑復雜，構建番茄紅素基因工程高產菌至今尚未取得突破性進展。因此，篩選和尋求合適的發酵促進劑，對提高該菌生物合成β-胡蘿卜素與番茄紅素的能力，降低生產成本，增加大規模發酵生產番茄紅素的技術可行性，將會有很大的實際意義。

綜上所述，試驗研究所用的發酵促進劑種類很多，大多數對番茄紅素的發酵作用是肯定的，隨著研究的不斷深入，作用顯著、使用方便的發酵促進劑將會在番茄紅素生產中得到普遍應用。

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