糙米蛋白及其酶解產物對喂食高脂飼料敘利亞金倉鼠脂質代謝的影響

張慧娟，Wally Yokoyama，張暉

1(江南大學食品學院，江蘇無錫，214122)2(美國農業部西部研究所，加利福尼亞，阿爾巴尼，94710)

動脈粥樣硬化是世界范圍內導致人類死亡的主要原因之一，它的作用機制并不清楚，但是各式各樣的動物實驗模型為我們近一步了解動脈粥樣硬化的發病機理提供了很好的平臺。兔子、大鼠、小鼠倉鼠、豬及其非人類的靈長類動物都已經被用于動脈粥樣硬化的研究［1］。盡管沒有一種動物模型與人體內脂質代謝過程完全吻合，但是大部分動物模型都對高脂高膽固醇的喂食有很好的反應。敘利亞金倉鼠(Mesocricetus auratus)具有膽固醇酯轉移酶和與人體相似的脂蛋白組成，以及對高脂高膽固醇飼料的敏感性，已經被廣泛用于脂質代謝的研究［2-4］。

膳食蛋白可降低人體內膽固醇含量以防止動脈粥樣疾病得到越來越多的重視［5］。許多研究表明，膳食蛋白及其酶解產物具有降低膽固醇活性的作用。如:大豆蛋白及其酶解產物［6-8］;牛乳球蛋白及其酶解產物等［9］;向日葵蛋白及其水解產物等［10］。Yang等報道了大米蛋白降低膽固醇的作用［11］，但是對于糙米蛋白及其酶解產物的降低膽固醇的作用鮮有報道。

糙米是去掉外殼后的全米粒，它含有皮層、糊粉層和胚芽等。與精米相比較，它含有更豐富的維生素、礦物質及膳食纖維。本實驗以敘利亞金倉鼠為動物模型，以酪蛋白為對照組，研究糙米蛋白及其水解產物對動物脂質代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料

黃油，Odell公司;玉米油，Sunny Select公司;魚油，Sigma公司;膽固醇，Sigma公司;纖維素，Dyete公司;酪蛋白，Dyete公司;玉米淀粉，Buffalo公司;DL-蛋氨酸，ICN公司;酒石酸氫膽堿，Dyete公司;L-賴氨酸，GNC公司;L-脯氨酸，Sigma公司;維他命混合物，Dyete公司;無機鹽混合物，Dyete公司;Tirtonx-100，Calbiochem公司;甘油三酯試劑盒，Genzyme公司;總膽固醇試劑盒，Wako Chemicals公司;游離膽固醇試劑盒，Wako Chemicals公司;總膽汁酸試劑盒，Diazyme公司。

1.1.2 主要儀器

日立L-8800氨基酸分析儀，日立公司;MACRO cube CNS定氮儀，Elementar analysensyteme公司;Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent公司;快速脂肪提取儀，Dionex公司;Nanodrop 2000 C分光光度計，Thermo Scientific公司;冷凍干燥機，Labconco公司;CRP離心機，Beckman公司;恒溫水浴鍋，Rechert公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糙米蛋白的制備及其酶解

取1 g糙米提取淀粉后的殘渣，加入10 mL去離子水，用0.5 mol/L NaOH調節pH值至8.5，在50℃，300 r/min的條件下反應2h。然后離心(3 000×g)20 min，取上清液，用0.1mol/L HCl溶液調節pH至3.8。離心(3 000×g)20 min，沉淀物冷凍干燥。將制備所得蛋白，用Alcalase2.4 L試劑進行酶解。酶解條件為:50℃，pH 8.5，攪拌速度300 r/min，酶解度達到18%時停止酶解反應。將所得產物冷凍干燥，備用。

1.2.2 糙米蛋白基本成分分析

蛋白質含量的測定:MACRO cube CNS定氮儀。

脂肪含量的測定:Dionex脂肪測定儀。

灰分含量的測定:AOAC 923.03。

膳食纖維含量的測定:AOAC 935.53。

1.2.3 實驗動物及其喂食

雄性敘利亞金倉鼠購于Charles River實驗室(Kingston Colony，Laboratory Area K62，Wilmington，MA)。動物到達后，喂食Chow(Purina Rodent Laboratory Chow)并置于20～22℃，相對濕度為60%，12 h燈照，12 h黑暗的環境下。1周后，稱重，并隨機分組。將實驗動物分為3組，分別為酪蛋白對照組(C)、糙米蛋白組(RBP)、糙米蛋白酶解物組(BRPH)。用這3種飼料喂食倉鼠3周，喂食期間，每周稱其體重，每周喂食2次。動物實驗的飼料組成如表1。

表1 動物實驗的飼料組成 g

1.2.4 動物解剖

將倉鼠禁食12 h，然后麻醉窒息死亡。腹部解剖，用含有K3EDTA溶液的注射器心臟取血，然后取出肝臟和其他器官，冷凍干燥，備用。

1.2.5 肝臟中脂肪的提取及總膽固醇(TC)和游離膽固醇(FC)含量的測定

肝臟中脂肪的提取使用Dionex快速脂肪提取儀，過程如下:將約0.5 g冷凍干燥后的肝臟樣品與少量沙子混合，放于盛有沙子的提取容器內，然后用沙子封頂，密封提取容器。將裝有樣品的提取容器放在儀器上，在60℃，2175psig條件下進行，用3∶2(體積比)的乙醚和異丙醇溶液提取。提取結束后，在37℃條件下，用氮氣干燥至恒重，稱重計算脂肪含量。然后將干燥的脂肪溶于V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=5∶2溶液，取0.55 mL容易轉移至新的試管中，加入2.2 mL，1%Triton X-100的氯仿溶液，混合均勻后，37℃，氮氣干燥。在干燥后的試管中加入1 mL去離子水，充分混合后在37℃恒溫水浴鍋內靜置1 h。分別使用 FC試劑盒(Wako Chemicals公司)和TC試劑盒(Wako Chemicals公司)進行TC和FC含量的測定。

1.2.6 倉鼠糞便的分析及其脂肪、TC、FC和膽汁酸含量的測定

動物實驗結束的前3 d，收集動物糞便，冷凍干燥，研磨，-20℃保存備用。倉鼠糞便中脂肪的提取及TC和FC含量的測定同1.2.5。

1.2.7 倉鼠糞便的膽汁酸含量的測定

根據Van Der Meer R等的方法進行了倉鼠糞便中膽汁酸的提取和測定［12］。將干燥的糞便約50 mg和1 mL叔丁醇-水(1∶1，體積比)加入到 eppendorf試管內，在漩渦振蕩器上混合10 s，然后放入37℃水浴振蕩器內15 min，再次用漩渦振蕩器混合10s，最后在10 000×g速度下離心2 min，取出上清液，用Diazyme膽汁酸試劑盒進行膽汁酸含量測定。

1.2.8 數據處理

所有的數據表示為平均值±SE，數據之間的顯著性分析通過Minitab 15軟件(Minitab INC.，State college，PA，USA)的 one-way ANOVA進行分析，其置信區間為P＜0.05。數據之間的相關性是pearson系數，通過SPSS軟件得到。

2 結果與討論

2.1 糙米蛋白基本成分分析(表2)

表2 糙米蛋白的基本組成

2.2 糙米蛋白及其酶解產物對倉鼠進食量、體重及器官重量的影響

從表3可以看出，實驗期間，倉鼠的體重增加量與肝臟重量呈現顯著的正相關關系(r=0.991，P＜0.05)。與對照組相比較，喂食含有BRPH的倉鼠，進食量增加了2%，而體重卻顯著降低(P＜0.05)，降低了12%，體重增加量降低了大約58%;但是BRP飼料組對倉鼠體重影響不顯著，同時，喂食BRPH飼料的倉鼠，肝臟重量降低了28.8%，但是BRP飼料組使倉鼠肝臟重量有所降低(9%)，但是未達到統計學上顯著性的水平。對于BRPH飼料組，倉鼠的附睪脂肪分別與倉鼠體重和腹膜后脂肪呈正相關關系(r=0.884，P＜0.01;r=0.874，P＜0.01)。BRP飼料組降低了倉鼠腹膜后脂肪含量，但是增加了其附睪脂肪含量。與對照組相比較，BRP飼料組對倉鼠脂肪總量無顯著影響。

表3 不同飼料對倉鼠進食量和體重的影響

2.3 糙米蛋白及其酶解產物對倉鼠肝臟總脂肪含量的影響

從圖1可以看出，與對照組相比較，喂食糙米蛋白及其酶解產物后的倉鼠，其肝臟總脂肪含量分別降低了9%和14%。這就說明糙米蛋白可以調節倉鼠的脂質代謝，糙米蛋白酶解產物則具有更好的效果，這可能是由于酶解后的低分子肽段更易于肝臟調節脂質代謝。

2.4 糙米蛋白及其酶解產物對倉鼠肝臟TC和FC的影響

肝臟在膽固醇的合成及運輸方面起著重要的作用，肝臟中膽固醇的含量也是影響動脈粥樣硬化的一個重要指標。圖2顯示出不同飼料組中倉鼠肝臟TC和FC的含量。從圖2可以看出，與對照組對比，BRP和BRPH飼料組可以顯著降低倉鼠肝臟中的膽固醇含量(P＜0.05)，降低量分別為22%和51%。這說明糙米蛋白可以降低肝臟中膽固醇的含量，但是經過Alcalase2.4L酶解后的產物，其作用更為顯著。BRP和BRPH飼料組對倉鼠肝臟游離膽固醇的含量影響不顯著，因此，BRP和BRPH飼料組使倉鼠肝臟中游離膽固醇和總膽固醇的比例增加，分別為對照組的1.2倍和1.8倍。

圖1 不同飼料組對倉鼠肝臟總脂肪含量的影響

圖2 不同飼料組對倉鼠肝臟TC和FC含量的影響

2.5 糙米蛋白及其酶解產物對倉鼠糞便中總脂肪含量的影響

從圖3可以看出，與對照組相比較，糙米蛋白和糙米蛋白酶解物可以增加倉鼠糞便中脂肪含量，其增加量分別為98%和120%。這可能是糙米蛋白及其酶解產物中的不易被消化的蛋白相當于膳食纖維的功能，促進了糞便中脂肪含量的增加。

圖3 不同飼料組對倉鼠糞便中脂肪含量的影響

2.6 糙米蛋白及其酶解產物對倉鼠肝臟倉鼠糞便中TC和FC含量的影響

從圖4可以看出，與酪蛋白相比較，糙米蛋白及其酶解產物對糞便中TC及FC排出量有顯著影響。糙米蛋白及其酶解產物可以顯著提高糞便中TC含量，其增加量分別為66%和68%，它們還提高糞便中FC含量，增加量分別為60%和48%。

圖4 不同飼料組對倉鼠糞便中TC和FC含量的影響

2.7 糙米蛋白及其酶解產物對倉鼠肝臟倉鼠糞便中膽汁酸含量的影響

從圖5可以看出，與對照組相比較，BRP飼料組使倉鼠糞便中膽汁酸的含量增加了27%，但是未達到統計學上的顯著增加。BRPH對倉鼠糞便中膽汁酸含量無顯著影響。這可能是由于糙米蛋白更容易結合膽汁酸，促進其排出體外。一些研究已經表明大豆蛋白的消化性低于酪蛋白，其不易被消化的部分可能會結合膽汁酸，促進膽汁酸排出體外［13］。

圖5 不同飼料組對倉鼠糞便中膽汁酸含量的影響

3 結論

實驗以酪蛋白為對照組，研究了糙米蛋白及其酶解產物對敘利亞金倉鼠體重、進食量及其器官重量;肝臟總脂肪含量、TC和FC含量以及倉鼠糞便中成分的影響。膳食蛋白及其酶解產物的降低膽固醇的機理尚不清楚，但是有一些機制已經被提出。機制1:膳食蛋白結合膽汁酸，使膽酸排出體外，促進膽固醇向膽汁酸的轉化，從而降低肝臟中膽固醇的含量;機制2:在小腸內膽固醇必須與膽汁酸和磷脂等結合，形成膠束結構才能被小腸上皮細胞吸收，膳食蛋白有可能會破壞膽固醇的膠束結構，使膽固醇聚集，從而阻止了膽固醇的吸收;機制3:膳食蛋白可以直接促進脂肪的排出。從本實驗的研究結果來看:BRP和BRPH飼料組都可以破壞膽固醇的膠束結構，促進膽固醇的排出;同時它們還可以促進脂肪的排出。盡管BRP和BRPH飼料組對倉鼠糞便中膽汁酸的排出無顯著影響，但是BRPH飼料可使糞便中膽汁酸的排出量有所增加。同時，還有研究表明，無異黃酮大豆蛋白可能降低與膽固醇代謝有關的酶(HMG-CoA還原酶)和與膽固醇吸收有關的酶(LDL-R)的mRNA表達量［14］，因此我們在后續實驗中將會進行與膽固醇代謝有關的基因的mRNA表達的研究。

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