產抗真菌蛋白(AFP)巨大曲霉的分離鑒定及AFP的提純

元月，王德良，，郭立蕓，林智平，江偉

1(新疆農業大學，新疆烏魯木齊，830000)2(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)3(北京燕京啤酒股份有限公司，北京，101300)

巨大曲霉(Aspergillus giganteus)是一種無害絲狀真菌，目前已廣泛應用于纖維素酶的工業生產。其所產的抗真菌蛋白(Antifungal Protein，AFP)是一種含有51個氨基酸的小分子量堿性蛋白，可有效抑制絲狀真菌的生長，特別是引起動植物致病的絲狀真菌，而細菌、酵母、植物和哺乳類動物細胞卻不會受到影響。許多研究表明，AFP在抑制絲狀真菌方面具有安全、高效、廣譜、穩定等特點［1］，可作為一種新型天然殺菌劑，應用于醫療、制藥、食品加工以及農業生產等多個領域。本研究主要介紹巨大曲霉的形態特征、分子鑒定及其抗真菌蛋白(AFP)的分離純化方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

共采集314份堿性土壤［2］，分別取自河北、山東、河南、山西以及新疆等地區。采樣時，去除上層5cm表土，取10～15cm深度的土壤，裝入無菌試管中，每份樣品約20 g。

1.1.2 主要培養基

查氏培養基:葡萄糖 20 g，NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl0.5g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蒸餾水 1 000 mL ，pH自然，加入2%的瓊脂，121℃濕熱滅菌20 min。

液體搖瓶培養基［3］:玉米淀粉20 g，牛肉膏15 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，121℃濕熱滅菌20 min。

麥芽汁瓊脂培養基:取澄清麥芽汁，加2%瓊脂，121℃，滅菌 30 min。

PDA培養基［4］:取馬鈴薯200 g去皮，切成塊煮沸30 min，用紗布過濾;加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，融化后補水至1 000 mL，121℃，滅菌20 min。

1.1.3 供試菌種

巨大曲霉AF-11由本研究篩選得到。

供試菌株:黃曲霉(Aspergillus flavs40191)、黑曲霉(Aspergillus niger2485)、圓弧青霉(Penicillium cyclopium40215)、禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum4598)、燕麥鐮孢菌(Fusarium avenaceum4594)和尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporium4591)，由中國工業微生物菌種保藏管理中心和中國食品發酵工業研究院釀酒部提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株篩選

首先從堿性土壤中分離霉菌［5-6］，并將初篩菌樣接種于麥芽汁瓊脂培養基進行復篩，于篩選平板上劃線分離至純種，編號并用斜面保存。以黃曲霉菌、黑曲霉菌、青霉菌、禾谷鐮孢菌、燕麥鐮孢菌和尖孢鐮孢菌作為測試菌，結合平板對峙法［7］和牛津杯擴散法，篩選具有抗真菌活性的目標菌種。

1.2.2 菌株鑒定

形態鑒定參見《中國真菌志》(第五卷)［8］、《微生物分類學》［9］及 Varga［10］等文獻中的方法進行。

參照文獻［8］對菌株92號進行趨光性和感光性生理特征實驗，即28℃下，對AF-11菌株分別進行單側光照射和暗光照射處理，并建立正常光照條件下空白對照，培養5d，對比2種不同條件下的菌落顏色。

參照巨大曲霉抗真菌蛋白AFP特異序列，設計引物序列，見表1。PCR反應體系(50 μL):10×PCRbuffer(5 μL)，dNTP(2.5 mmol/L，4 μL)，primer 1(10 μmol/L，1 μL)，primer 2(10 μmol/L，1 μL)，Taq 酶(5 units/μL，0.5 μL)，Template(4 μL)，ddH2O 補至 50 μL。反應程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環;72℃ 8 min，4℃保溫。取 5 μL PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測，電泳結束后用凝膠成像系統觀察結果，樣品于-20℃保存。

表1 巨大曲霉特異性引物序列

PCR產物經純化后，送交上海生工生物工程有限公司測序。選擇測序結果中可信度較高的區域，提交至NCBI-BLAST網站進行比對。

1.2.3 抗真菌蛋白(AFP)的分離純化

發酵液離心(10 000 r/min，15 min)取上清液并調整pH 7.0。以CM-52為填料，裝成φ2.6 cm×40 cm陽離子交換柱，配制TE緩沖液，上樣后填料終濃度為50g/L。設置紫外檢測儀在280 nm檢測，流速1 mL/min，平衡30 min。加入發酵上清液后，上清液中的正價基團將吸附在柱填料上，隨后加入含鈉鹽TE緩沖液進行洗脫，所得餾分透析后經真空冷凍干燥濃縮至2～4 mL，4℃保存。

取上述步驟所得餾分2 mL，加入Sephadex G-50凝膠柱層析系統(柱規格:φ1.6 cm×100 cm，填料終濃度為5 g/L)。用醋酸鈉緩沖液(0.05 mol/L醋酸鈉+0.1 mol/L NaCl)進行洗脫，設置流速0.5 mL/min，同時用紫外檢測儀在280 nm進行檢測。分別收集各吸收峰對應的餾分，透析后經真空冷凍干燥濃縮至2～4 mL［3，15］。所得濃縮蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測［16-17］，觀察含有分子質量約為6.3 ku的蛋白質餾分組，并將其濃縮至2 mL，重復凝膠層析操作，所得蛋白餾分經真空冷凍干燥制粉，于-20℃保存。

1.2.4 SDS-PAGE檢測

該試驗選用低分子量蛋白質電泳體系，凝膠由16.5%分離膠、10%夾層膠和4%濃縮膠3部分構成［16］。Marker為超低分子量蛋白質標準品，分子質量范圍為3.3～20.1 ku。蛋白樣品經樣品緩沖液溶解處理后上樣，Marker上樣量為15 μL，蛋白樣品上樣量為20 μL。待電泳結束，凝膠固定20 min，考馬斯R-250染色1 h，并用微波法快速脫色。

1.2.5 抗真菌蛋白(AFP)的鑒定

取聚丙烯酰胺凝膠電泳上的目標條帶，送交上海生工生物工程有限公司進行蛋白測序。選擇蛋白測序結果中可信度較高的區域，提交至NCBI-BLAST網站進行比對。

1.2.6 抗真菌蛋白最低抑制濃度(MIC)

以黃曲霉菌、黑曲霉菌、青霉菌、禾谷鐮孢菌、燕麥鐮孢菌和尖孢鐮孢菌為測試菌，分別制備濃度為103CFU/mL菌懸液備用。配制8組液體培養基，均添加純化的 AFP并使終濃度分別達到1、3、5、7、9、12 μg/mL 和 15 μg/mL，最后 1 組為空白對照組。各組分別添加0.1 mL黃曲霉菌的菌懸液，于28℃條件下液體培養36 h，結合分光光度計法［18］和顯微鏡觀察各組生長情況，無菌生長即為最低抑制濃度(MIC)。按上述步驟處理其他測試菌，各組均重復3次試驗。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

從土壤樣品中分離出220株菌，其中具有抑制絲狀真菌活性的霉菌11株，編號分別為菌株23號、菌株25號、菌株48號、菌株52號、菌株63號、菌株72號、菌株80號、菌株92號、菌株103號、菌株115號、菌株127號。經抑菌活性試驗鑒定，菌株92號及其發酵液對試驗指示菌都有明顯的抑制作用，以無菌水為對照，每個處理重復3次求平均值，于28℃下恒溫培養3 d，測量各個處理的菌落直徑并計算抑菌率，見表2。圖1為菌株92號對黃曲霉菌和青霉菌的抑制實驗。

表2 菌株92號對各供試菌的抑制作用

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態特征

菌株92號在查氏瓊脂平板上25℃培養7 d，菌落直徑約為28～35 mm，10天后約40～50 mm;初期平薄，而后產生大量分生孢子結構，質地絲絨狀;呈藍灰色，老后變成帶褐色，反面現褐色;無滲出液，無明顯氣味。菌落置于散射光下有些分生孢子梗很長，在邊緣處尤為顯著。分生孢子頭為球形，而后呈棒形，直徑26～40 μm;分生孢子橢圓形，3.5 μm ×2.5 μm，光滑。初步鑒定其屬于叢梗孢科的曲霉屬，如圖2。

圖1 菌株92號對霉菌的抑制作用

圖2 菌株92號形態學鑒定

2.2.2 生理生化特性鑒定

趨光性試驗結果顯示，該菌分生孢子?？蓮澫騿蝹裙庠瓷L，結果為陽性(圖3，A)。感光性試驗結果顯示，無光的條件下呈白色(圖3，B左);有光照的條件下，菌落呈現藍綠色(圖3，B右)，結果為陽性。趨光性和感光性是巨大曲霉特有的生理特征，其他的棒狀曲霉沒有或不兼有上述生理特征。

圖3 菌株92號趨光性和感光性試驗

瓊脂糖凝膠電泳檢測菌株92號的總DNA，觀察其長度約為20 Kbp。對26SrDNA D1/D2區序列進行擴增，得到長度約為450 bp的片段，與文獻提供的巨大曲霉AFP開放閱讀框片段大小相一致［14］，且無非特異性擴增條帶，經純化后可以進行測序反應。

2.2.4 DNA測序結果

將PCR產物純化后送交測序，所得序列與Gen-Bank數據庫中的序列進行比較分析，測序結果顯示，該序列與已發表的巨大曲霉特異性抗真菌蛋白AFP的開放閱讀框序列(X60771.1)一致，菌株92號與巨大曲霉菌的同源性達100%。

通過上述形態鑒定、生理生化特性試驗以及26s區序列分析，可知菌株92號與巨大曲霉菌的特性完全吻合，同源性達到100%，基本確定菌株92號為巨大曲霉菌(Aspergillus giganteus)，編號AF-11。

2.3 巨大曲霉抗真菌蛋白(AFP)的分離純化

2.3.1 CM-52陽離子交換層析

Theis等人［3］于2003年通過試驗將AFP抗真菌蛋白從巨曲霉菌IfGB0902的發酵上清液中分離出來，并建立了用磷酸纖維素代替羧甲基纖維素作為陽離子交換劑的AFP提純方法。當離子交換柱層析系統上樣后，發酵上清液中的正價基團將吸附在CM-52陽離子交換柱上，其他組分和雜質隨緩沖液最先流出，經280 nm紫外檢測，在層析譜圖上產生一個雜峰;持續加入TE緩沖液直至恢復基準平衡并維持15 min，開始加入鈉鹽洗脫液，此時正價基團被釋放，在層析譜圖上產生一個正價基團峰，如圖4。收集正價基團峰所對應的餾分，經透析除鹽后，真空冷凍干燥(0.011 MPa，-80℃)濃縮至2 mL，于4℃保藏備用。

圖4 CM-52陽離子交換層析圖

2.2.3 菌株92號總DNA提取與26SrDNA D1/D2區序列擴增

2.3.2 Sephadex G-50凝膠柱層析

Sephadex G-50凝膠柱層析系統平衡后，注入離子交換所得濃縮樣品2 mL，繼續加入醋酸鈉緩沖液進行洗脫，設置紫外檢測儀波長為280 nm。樣品中的蛋白組分按分子從大到小的順序隨緩沖液依次被分離出來，在層析譜圖出現對應的吸收峰，如圖5。由圖5看出，整個層析過程共分離出5個洗脫峰，分別收集各峰餾分，經透析除鹽后，真空冷凍干燥(0.011 MPa，-80℃)濃縮至1 mL，-20℃保存。為提高樣品純度，濃縮樣分別進行第2次凝膠層析操作，所得餾分濃縮后進行SDS-PAGE檢測。

圖5 Sephadex G-50凝膠柱層析圖

2.3.3 SDS-PAGE檢測結果

SDS-PAGE檢測結果見圖6。

查文獻可知，巨大曲霉所產抗真菌蛋白(AFP)的分子量約為6.3ku［13，19］。經檢測，凝膠層析所得第5組餾分的泳道上出現了與該類蛋白分子量大小相近的明顯條帶(圖6，D)。經2次凝膠層析純化后，得到單一條帶(圖6，E)，由圖顯示該處理方法得到的蛋白濃縮液為電泳純。

圖6 SDS-PAGE電泳圖

2.3.4 蛋白質序列檢測結果

將電泳膠板送交測序，所得序列與GenBank數據庫中的已知蛋白質序列進行比較分析。檢測結果顯示，該段蛋白序列與已發表的巨大曲霉所產抗真菌蛋白(AFP)的特異序列(CAA37523.1和P17737.2)基本一致，序列覆蓋度分別為100%和98%。由特異性蛋白序列分析結果可進一步驗證，菌株AF-11為巨大曲霉，所產蛋白為巨大曲霉抗真菌蛋白(AFP)。

2.3.5 抗真菌蛋白(AFP)抑菌活性試驗結果

根據實驗結果繪制折線圖，如圖7。

圖7 不同濃度AFP對各測試菌生長的抑制作用

由圖7可知，抗真菌蛋白(AFP)對于不同菌種的抑制濃度也不同。如AFP對黃曲霉的最低抑制濃度約為3μg/mL，對禾谷鐮孢菌和燕麥鐮孢菌的最低抑制濃度均為3μg/mL。實驗證明，AFP可在低水平含量條件下抑制絲狀真菌，有效降低測試菌產毒素的含量。

3 討論

由于曲霉屬微生物形態相似，生理生化特征也很相近，單從傳統方法很難將其鑒定。本研究將形態特征鑒定與分子鑒定相結合，對巨大曲霉菌做了更為全面和細致的鑒定。

研究表明，巨大曲霉菌可產生具有抗真菌活性的肽類物質——AFP，能有效抑制產毒絲狀真菌的生長并緩解真菌毒素殘留問題;利用陽離子交換層析和凝膠層析交替結合的方法可有效提取高純度的AFP;對于不同的真菌，AFP的使用量也不同;AFP的作用時限和高產優化條件仍需要進一步試驗驗證。

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